肝細(xì)胞ABCB4基因與膽囊膽固醇結(jié)石關(guān)系的研究.pdf

1、目的：探討膽囊膽固醇結(jié)石的形成與ABCB4基因表達的相關(guān)性，為研究膽囊膽固醇結(jié)石的成因從分子水平提供新的依據(jù)，以及為進一步研究預(yù)防膽囊膽固醇結(jié)石提供新的理論基礎(chǔ)。 方法：以膽囊膽固醇結(jié)石患者的肝臟組織14例作為實驗組（男性9例，女性5例，平均年齡49歲），以非膽囊結(jié)石患者的肝臟組織10例為對照組（男性5例，女性5例，平均年齡45歲）。兩組入選患者均不伴有膽管結(jié)石。膽囊膽固醇結(jié)石組均為手術(shù)中證實的膽囊結(jié)石患者；取出的膽囊結(jié)石需進一

2、步經(jīng)紅外光譜法進行成分分析，其膽固醇含量大于70%者方認(rèn)定為膽囊膽固醇結(jié)石。非膽囊結(jié)石組為經(jīng)過手術(shù)前腹部B超及手術(shù)中證實為無膽囊結(jié)石存在的患者。兩組入選患者均需排除心血管系統(tǒng)疾病、高脂血癥、糖尿病、甲狀腺疾病、妊娠、服用避孕藥物、惡性腫瘤，以及肝腎疾病等疾病存在。實驗方法分為以下兩個環(huán)節(jié)：①提取結(jié)石組和對照組肝臟組織的RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)（RT—PCR）技術(shù)檢測兩組患者肝臟組織的ABCB4基因表達的強度；②提取結(jié)石組和對照組

3、肝臟組織，冰凍切片后用免疫組織化學(xué)染色方法檢測兩組患者肝臟組織P—糖蛋白Pgp3的表達強度。 結(jié)果：⑴電泳結(jié)果顯示：實驗中所有擴增產(chǎn)物都出現(xiàn)了內(nèi)參β—actin基因的328bp擴增帶和ABCB4基因的289bp擴增帶，膽囊膽固醇結(jié)石組ABCB4基因擴增帶亮度明顯弱于對照組。半定量結(jié)果分析：利用Quantity One軟件計算比較每一泳道中PCR產(chǎn)物條帶的光密度值，計算ABCB4基因與β—actin條帶的光密度的相對比值，通過比較

4、各樣本ABCB4基因的相對值，最終得出ABCB4基因在肝臟組織中mRNA表達的相對含量。半定量結(jié)果的相對光密度值需每組每一實驗對象同等處理條件下均重復(fù)測定3次，取其最終平均值作為統(tǒng)計用數(shù)據(jù)。最后結(jié)果顯示：膽囊膽固醇結(jié)石組患者ABCB4基因mRNA表達較低（0．9075±0．0606），對照組患者ABCB4基因mRNA表達則高（1．1538±0．0420），表達差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（t=—11．062 P<0．05）。⑵免疫組織化學(xué)染色

5、結(jié)果顯示：在高倍物鏡下肝細(xì)胞膜的毛細(xì)膽管出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為陽性細(xì)胞。每張切片隨機選取5個視野，每個視野內(nèi)觀察100個細(xì)胞，陽性細(xì)胞≥10%為陽性，否則為陰性。利用四格表的Fisher確切概率法檢驗結(jié)果示：膽囊膽固醇結(jié)石組患者Pgp3表達陽性率為14．29%（2/14），對照組患者Pgp3表達陽性率為80%（8/10）。兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（X2=9．932 P<0．05）。 結(jié)論：①膽囊膽固醇結(jié)石患者的ABCB4基因mR