丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4A、4B與肝細(xì)胞相互作用的機(jī)制研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)感染不僅引起急、慢性病毒性肝炎，而且與肝纖維化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。病毒感染肝細(xì)胞后，病毒的核酸、蛋白與肝細(xì)胞的核酸、蛋白等生物大分子之間的相互作用是病毒致病的主要分子機(jī)制之一。HCV基因組長(zhǎng)約9.6kb，含有一個(gè)長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框架(ORF)，編碼一個(gè)約3010～3033個(gè)氨基酸殘基(aa)的多蛋白前體，經(jīng)宿主細(xì)胞信號(hào)肽酶和病毒蛋白酶加工成至少十種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，C、

2、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。目前還發(fā)現(xiàn)核心蛋白C的編碼基因通過(guò)移框從而編碼一種新的17kD的F蛋白，這些蛋白在病毒的復(fù)制和繁殖中各有不同的功能，但某些具體機(jī)制尚不清楚。本研究以兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A、NS4B為研究對(duì)象，旨在探討HCVNS4A和NS4B蛋白對(duì)肝細(xì)胞基因表達(dá)譜的調(diào)節(jié)及與肝細(xì)胞蛋白之間的相互作用，對(duì)于了解HCVNS4A、NS4B蛋白的致病機(jī)制及尋找有效防治HCV的方法具有重要意義

3、。 為研究NS4A、NS4B蛋白的反式激活功能，我們構(gòu)建了NS4A、NS4B的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-NS4A和pcDNA3.1(-)-NS4B，分別將其與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒pCAT3-Promoter(含有SV40早期啟動(dòng)子)共轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞中氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因的表達(dá)活性；以表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-NS4A和pcDNA3.1(-)

4、-NS4B轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，空載體pcDNA3.1(-)為平行對(duì)照，制備轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞裂解液，應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)(suppressionsubtractivehybridization，SSH)，構(gòu)建HCVNS4A、NS4B反式激活相關(guān)基因差異表達(dá)的cDNA消減文庫(kù)，對(duì)篩選的克隆進(jìn)行測(cè)序及同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NS4A、NS4B能夠反式激活SV40啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促使其調(diào)控的下游CAT基因表達(dá)增強(qiáng)，NS4B的反式激活作用強(qiáng)于N

5、S4A。消減雜交分析顯示，NS4A、NS4B能夠上調(diào)肝細(xì)胞中多種基因的表達(dá)，包括與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)翻譯合成、腫瘤發(fā)生及物質(zhì)代謝密切相關(guān)的蛋白編碼基因；此外，我們還篩選到兩個(gè)新基因，分別命名為NS4A反式激活基因NS4ATP1和NS4ATP2，GenBank號(hào)分別為AY740521和AY846876。為篩選NS4A、NS4B的肝細(xì)胞結(jié)合蛋白，我們分別構(gòu)建了NS4A、NS4B的酵母表達(dá)載體pGBKT7-NS4A和pGBK

6、T7-NS4B，并轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109，以SDS-PAGE和Westernblotting分析蛋白表達(dá)。以NS4A、NS4B為誘餌蛋白，應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)，在肝細(xì)胞文庫(kù)中釣取NS4A、NS4B的肝細(xì)胞結(jié)合蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NS4A、NS4B在AH109酵母細(xì)胞中成功表達(dá)出相對(duì)分子量為27kD和48kD的融合蛋白。雙雜交結(jié)果顯示，NS4A可與7種肝細(xì)胞蛋白相互作用，包括金屬硫蛋白、真核翻譯延伸因子1-α、血清白蛋白、RNA結(jié)合基序蛋白、肌漿

7、球蛋白結(jié)合蛋白、細(xì)胞色素C氧化酶Ⅱ及Na+K+ATP酶β1亞基。NS4B可與5種肝細(xì)胞蛋白相互作用，包括NADH脫氫酶亞單位3、細(xì)胞色素C氧化酶Ⅲ、視黃醇結(jié)合蛋白4、神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白及纖維蛋白原γ多肽。上述結(jié)果提供了HCVNS4A、NS4B蛋白在體內(nèi)可能存在的調(diào)控機(jī)制的線索。 我們進(jìn)一步對(duì)兩個(gè)新基因功能進(jìn)行了初步探討。將分子生物學(xué)技術(shù)與生物信息學(xué)技術(shù)相結(jié)合，首先從人肝癌細(xì)胞中成功克隆并鑒定了NS4ATP1和NS4ATP2基因

8、的全長(zhǎng)編碼序列?；谠吮磉_(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、成本低、表達(dá)蛋白量高等優(yōu)點(diǎn)，我們利用pET32a(+)原核表達(dá)載體和相應(yīng)的BL21(DE3)菌株，在體外成功表達(dá)了NS4ATP1和NS4ATP2蛋白。鑒于酵母中表達(dá)的蛋白質(zhì)能在酵母細(xì)胞中正確折疊與翻譯后修飾，我們又構(gòu)建了NS4ATP1和NS4ATP2的酵母表達(dá)載體，并在酵母細(xì)胞中成功表達(dá)了相應(yīng)的融合蛋白。上述結(jié)果為下一步兩種新蛋白具體的生物學(xué)功能、基因表達(dá)調(diào)控的深入研究提供了基礎(chǔ)。