乙型肝炎病毒HBx蛋白與肝細(xì)胞蛋白的相互作用及對(duì)其功能的影響.pdf

1、乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus, HBV)感染可引起急慢性乙型肝炎、肝硬化，并與原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,但其具體致病機(jī)制尚不十分清楚。HBV基因組長(zhǎng)約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA，含有4個(gè)開放讀碼框（open reading frame，ORF），即：S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)、X區(qū)。HBx蛋白是由HBV基因組X開放讀碼框編碼的長(zhǎng)度為154個(gè)氨基酸的蛋白，大小為16.5kDa。HBx具有多種功能，在HBV致病過程

2、中發(fā)揮重要作用，是HBV最重要的致病因子之一。本研究利用CytoTrap酵母雙雜交方法篩選與HBx蛋白相互作用的肝細(xì)胞蛋白，進(jìn)一步在體內(nèi)外確定HBx蛋白可以與ECSIT和VCP發(fā)生相互作用，并探討HBx蛋白對(duì)ECSIT和VCP功能的影響，最后探索其致病機(jī)制。
　　 本研究第一部分利用CytoTrap酵母雙雜交方法篩選與HBx蛋白發(fā)生相互作用的肝細(xì)胞蛋白。為此，構(gòu)建了用于CytoTrap酵母雙雜交的pSos-HBx誘餌載體并證實(shí)其

3、在酵母中可表達(dá)Sos-HBx融合蛋白。在確定Sos-HBx在CytoTrap酵母雙雜交系統(tǒng)中無自激活作用基礎(chǔ)上，以pSos-HBx篩選并得到30種與HBx相互作用的肝細(xì)胞蛋白，即：MYPK、TCTP、EKI1、ECSIT、MRLC2、VCP、USP15、PSMC1、PSMD4、YWHAH、FN1、NACA、MPP6、GSTO1、TOMM70A、ORM2、ITIH3、SF3A3、PREPL、PTPRA、SMARCC1、BRWD2、CP、E

4、TNK1、PPM1A、LSM8、AMACR、AFM、IQWD1、RBX1。
　　 本研究第二部分通過GST pull-down實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）進(jìn)一步證實(shí)了HBx蛋白可以與ECSIT（evolutionarily conserved signaling intermediate in toll pathways）及含纈酪肽蛋白（valosin-containing p

5、rotein，VCP）在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。并且利用CytoTrap酵母雙雜交技術(shù)確定了HBx蛋白的第51～80氨基酸介導(dǎo)與ECSIT的相互作用，第51～120氨基酸介導(dǎo)與VCP的相互作用。
　　 本研究的第三部分旨在探討HBx蛋白對(duì)ECSIT或VCP相關(guān)功能的影響。利用螢火蟲熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，HBx蛋白可以促進(jìn)ECSIT或VCP所介導(dǎo)的NF-κB激活作用。提示HBx通過與ECSIT或VCP的相互作用，參與了HBV的