乙型肝炎病毒復制與肝細胞核酸識別受體相互作用研究.pdf

1、目的:
　　在持續(xù)表達HBV的HepG2.215細胞模型及pBS-HBV1.3瞬時轉(zhuǎn)染細胞模型中觀察HBV復制對HepG2細胞內(nèi)核酸識別受體及相關分子表達的影響；比較HBV（+）肝癌組織與HBV（-）肝癌組織IFI16的表達差異，并探討HBV復制與細胞內(nèi)DNA識別受體IFI16的相互作用及其機制。
　　方法:
　　1.提取HepG2及HepG2.215細胞總RNA，RT-qPCR檢測核酸識別受體及相關分子的表達；

2、>　　2.采用pBS-HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細胞系（HepG2，Huh7），分別在不同時間點提取細胞總RNA，RT-qPCR檢測核酸識別受體及相關分子的表達；
　　3.采用IHC及RT-qPCR檢測HBsAg（+）與HBsAg（-）肝癌患者肝組織及外周血白細胞IFI16表達；RT-qPCR，Western blot，IF及激光共聚焦顯微鏡檢測IFI16在HepG2.215細胞和HepG2細胞中的表達及分布模式；
　　4.采

3、用pBS-HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細胞系（HepG2，Huh7），在0h，12h，24h，36h，48h后分別提取細胞總RNA及蛋白，RT-qPCR及Western blot檢測IFI16的表達；ELISA檢測細胞上清中HBsAg和HBeAg表達水平；
　　5.采用不同濃度IFI16-FL與pBS-HBV1.3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細胞，ELISA檢測細胞上清中HBsAg和HBeAg表達水平；RT-qPCR檢測細胞上清中HBV-DN

4、A水平；同樣方法檢測HepG2.215細胞過表達IFI16對HBV復制和表達的影響；
　　6.比較HBsAg（+）與HBsAg（-）肝癌患者外周血白細胞中IFI16，IRF3，IFN-β，NF-κB等的表達情況；IFI16-FL與pBS-HBV1.3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細胞或IFI16-FL單獨轉(zhuǎn)染HepG2.215細胞，RT-qPCR檢測細胞中IFI16，IRF3，IFN-β，NF-κB等表達情況。
　　結果:
　　

5、1.RT-qPCR檢測結果表明，與HepG2細胞相比，HepG2.215細胞中上調(diào)的基因包括RIG-I，MDA-5和MyD88等；下調(diào)的基因包括IFN-β，IRF-3和IFI16等；
　　2.pBS-HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細胞系（HepG2，Huh7）后可以啟動短暫的固有免疫應答，激活RIG-I，IFI16等核酸識別受體一過性升高；
　　3.IHC結果顯示HBsAg（+）肝癌組織中IFI16蛋白呈陰性表達，HBsAg（-）

6、肝癌組織中呈中度陽性表達；HBsAg（+）組外周血白細胞中IFI16 mRNA水平亦低于HBsAg（-）組；HepG2.215細胞中IFI16 mRNA的表達水平顯著低于HepG2細胞，IFI16蛋白表達量與HepG2細胞相比也顯著降低，其表達均在細胞核內(nèi)；
　　4.pBS-HBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2和Huh7后，Western blot和RT-qPCR檢測顯示IFI16的mRNA及蛋白表達水平隨時間延長而遞減；ELISA結果

7、顯示細胞培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的分泌隨時間延長而遞增；
　　5.隨著轉(zhuǎn)染IFI16真核表達質(zhì)粒的增加，HepG2細胞上清中HBV-DNA及HBsAg和HBeAg含量逐漸下降，HepG2.215細胞中檢測到相似作用；
　　6.共轉(zhuǎn)染IFI16-FL與pBS-HBV1.3質(zhì)粒后RT-qPCR檢測HepG2細胞中IRF3，IFNβ，NF-κB等基因的表達相對上調(diào)；HepG2.215細胞轉(zhuǎn)染IFI16-FL質(zhì)粒后上述基因的

8、表達亦相對上調(diào)。
　　結論:
　　1.HepG2細胞與持續(xù)表達HBV的HepG2.215細胞之間以及轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染pBS-HBV1.3質(zhì)粒的肝癌細胞系之間核酸識別受體及相關分子的表達存在差異，這些差異表達的分子有可能與HBV持續(xù)感染的發(fā)生相關；
　　2.瞬時轉(zhuǎn)染和持續(xù)表達HBV的肝癌細胞系中IFI16表達下調(diào)，提示HBV復制對IFI16的表達具有抑制作用，IFI16過表達亦可能通過IFI16-STING-IRF3-IFN