丙型肝炎病毒非結構蛋白NS5A與細胞蛋白FKBP38相互作用及對細胞凋亡影響的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒非結構蛋白NS5A與細胞蛋白FKBP38相互作用及對細胞凋亡影響的研究 丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)是一個全球性的危害人類健康的重要病原體，感染機體后極易導致慢性肝炎、并引起肝纖維化、肝硬化、肝壞死，最終導致肝癌。目前對于丙型肝炎病毒致病機制的了解仍然非常有限。研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒的致病性除了病毒本身因素外，病毒蛋白與宿主細胞蛋白的相互作用在其中發(fā)揮重要作用。在組成病毒的結構蛋白(Struc

2、turalProtein)和非結構蛋白中(Non-structuralProtein)，非結構蛋白5A(NS5A)通過與細胞蛋白的相互作用在信號轉導、胞內(nèi)物質轉運、抗細胞凋亡以及其它的一些方面發(fā)揮了重要作用，并且許多相互作用的后果都能維持或促進病毒在細胞內(nèi)的持續(xù)復制，但其詳細機制有待進一步明確。本文以NS5A蛋白為釣餌，通過篩選人胎肝細胞cDNA基因文庫，尋找與HCVNS5A蛋白相互作用的細胞蛋白，在此基礎上進一步確認NS5A與細胞蛋白

3、的相互作用并研究其生物學意義。 首先構建了HCVNS5A酵母表達質粒，并利用Ga14酵母雙雜合系統(tǒng)對人胎肝細胞cDNA文庫進行篩選。通過第一輪篩選初步獲得陽性候選克隆后，將上述克隆再次分別與NS5A釣餌質粒共轉化酵母細胞進行第二輪驗證，獲得十二個陽性克隆。測序后通過Blast檢索發(fā)現(xiàn)這十二個克隆含有兩個cDNA序列，分別編碼38kD免疫抑制劑FK506結合蛋白(38kDimmunosuppressantFK506-binding

4、protein，F(xiàn)KBP38)和ADP核糖基化樣因子6的作用蛋白(ADP-ribosylation-likefactor-6interactingprotein1，Aip-1)。已有文獻報道，NS5A可以通過不同途徑抑制細胞凋亡，而FKBP38能通過其跨膜端將Bcl-2抗凋亡家族的兩個分子Bcl-2和Bcl-xL錨定到線粒體外膜上從而發(fā)揮抗凋亡作用。由此可以推測NS5A與FKBP38的相互作用有可能參與抑制細胞凋亡，值得作進一步研究。

5、 為進一步驗證NS5A與FKBP38的相互作用，首先通過體外翻譯獲得35S標記的NS5A和帶HA標簽的FKBP38。免疫共沉淀結果顯示在HA抗體存在下，NS5A和HA-FKBP38在體外可發(fā)生物理上的結合。進一步構建NS5A-myc和HA-FKBP38真核表達質粒并共轉Cos7非洲綠猴腎細胞，結果發(fā)現(xiàn)無論是加入myc抗體還是HA抗體，這兩個蛋白始終在免疫復合物中被檢測到。進一步在HCV亞基因組復制子細胞的裂解液中，加入上述蛋白抗體

6、也獲得同樣結果。同時，通過免疫共沉淀還發(fā)現(xiàn)FK506并不影響上述兩個蛋白的結合。然后應用免疫熒光和激光共聚焦掃描確認兩者在細胞內(nèi)的相互作用。結果顯示無論是瞬時共轉還是在HCV亞基因組復制子細胞中，這兩個蛋白均存在于胞漿的相同位點。進一步利用亞細胞器特異性染料和標志蛋白進行激光共聚焦發(fā)現(xiàn)FKBP38定位于內(nèi)質網(wǎng)和線粒體，而NS5A定位于內(nèi)質網(wǎng)并有部分存在于線粒體。進一步運用Gal4酵母雙雜合系統(tǒng)和激光共聚焦進行突變體分析，發(fā)現(xiàn)NS5A的1

7、48-236位氨基酸參與了和FKBP38的相互作用，且這一片斷包含一個Bcl-2同源區(qū)；而FKBP38的跨膜區(qū)對它與NS5A的結合也至關重要。上述結果證明NS5A和FKBP38之間存在直接的相互作用。 為研究NS5A與FKBP38相互作用對細胞凋亡的影響，建立了表達NS5A的Huh7-NS5A穩(wěn)定細胞株。利用該細胞株和HCV亞基因組復制子細胞，發(fā)現(xiàn)這兩種細胞都能抑制凋亡誘導劑引起的細胞凋亡；當用siRNA干擾技術抑制HCV亞基因

8、組復制子細胞中的NS5A后，復制子細胞部分恢復凋亡敏感性，提示NS5A具有抗凋亡活性。另一方面，利用siRNA干擾技術抑制內(nèi)源性FKBP38表達后發(fā)現(xiàn)這兩種細胞部分恢復對凋亡誘導劑的敏感，而對照細胞無明顯差異，提示NS5A的這種抗凋亡活性依賴于FKBP38。在Huh7-NS5A穩(wěn)定細胞株中通過siRNA干擾FKBP38后檢測凋亡誘導劑誘導凋亡后PARP剪切體的量，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定細胞株中被剪切的PARP量明顯較少，說明NS5A的抗凋亡作用可能是

9、通過穩(wěn)定線粒體的方式實現(xiàn)。鑒于Bcl-2在Huh7細胞中缺如，以上結果提示在Huh7細胞中NS5A可能發(fā)揮類似抗凋亡分子Bcl-2的作用，并且這種作用可能是通過FKBP38實現(xiàn)。 綜上所述，本文應用Gal4酵母雙雜合系統(tǒng)以HCVNS5A為誘餌對人胎肝cDNA文庫進行了篩選，發(fā)現(xiàn)FKBP38是NS5A的相互作用蛋白。在確認NS5A與FKBP38相互作用的基礎上，研究了這種相互作用對細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)了NS5A抑制細胞凋亡可通過F