殺傷性人工抗原提呈細胞治療小鼠皮膚移植排斥及其對治療鼠整體免疫功能的影響.pdf

1、選擇性清除或抑制同種反應性T細胞是治療移植排斥和自身免疫病等的理想策略之一，因為它能避免免疫抑制劑所導致的患者整體免疫功能損傷。因此，幾十年來人們一直在探索各種特異性免疫療法，殺傷性人工抗原提呈細胞(Killer artificial antigenpresenting cell,KaAPC)就是其中之一。KaAPC是利用基因工程的方法使現(xiàn)有的抗原提呈細胞表面表達Fas配體，并通過細胞膜上的pMHC分子靶向結合抗原特異性T細胞，同時通過

2、膜上的FasL與活化后T細胞膜上的Fas分子結合從而誘導T細胞凋亡。這種策略對同種移植排斥、自身免疫病及變態(tài)反應等的治療都有很多成功的報道。然而，殺傷性細胞療法同時也遭到強烈的質疑:除了生物安全性和原代DC等細胞的大規(guī)模制備困難外，更重要的是FasL在載體細胞膜上的表達水平難以均勻的控制。為了避免細胞性療法的這些缺陷，近年來人們轉而關注以非細胞性物質為載體，標記pMHC多聚體和FasL，制備靶向殺傷性制劑。這種非細胞性的KaAPC在體內

3、的靶向殺傷效應仍少有報道。
　　本論文利用在人體內可生物降解、有組織相容性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球(poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA)共吸附H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗，制作以H-2kb分子為靶向抗原的KaAPCs，研究其治療小鼠皮膚移植排斥的效果及其對治療鼠整體免疫功能的影響。結果顯示:KaAPCs治療能明顯延長皮膚移植物的存活期，治療鼠的整體免疫功能如抗腫瘤能力和對第三方供

4、體的同種反應能力等也沒有明顯受損。主要結果如下:
　　1)利用雙乳化劑揮發(fā)法成功制備了表面功能化的、直徑4.5μm的PLGA微球。掃描電鏡、Zeta電位和粒徑分析顯示其具有良好的表征:呈規(guī)則球形，表面完整，61.2％的微球直徑在4.0-5.0μm，平均Zeta（ξ-）電位為36.3mV±6.11 mV，分散性好，表面氨基基團豐富;BSA和單抗包被實驗顯示其有良好的蛋白負載能力:對BSA的最大負載量為54.2μg/5×106 bea

5、ds;利用H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗共包被PLGA微球，成功制備以H-2Kb分子為靶向抗原的KaAPCs，單抗染色和流式分析證實有正確表型。
　　2)以C57BL/6鼠(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)為皮膚移植的供受體，在移植術后第5、7、9天經(jīng)尾靜脈分別注射KaAPC、anti-Fas PLGA、Blank PLGA或PBS進行分組治療，然后:在第12天取各組脾細胞，CFSE標記后在體外與第三方KM

6、鼠的脾細胞行單向混合淋巴細胞培養(yǎng)3天和7天，流式分析各組治療鼠CD3+T細胞群的同種增殖能力;皮膚移植術后第3天皮下注射SP2/0骨髓瘤細胞，而后進行分組治療，并每天測量腫瘤大小，第23天時殺鼠取腫瘤組織，稱重，制冰凍切片后FITC-anti-mouse CD3單抗染色。結果顯示:KaAPC治療組皮膚移植物的中位存活時間比對照組延長4.5-7天;治療鼠脾臟T細胞在體外對第三方小鼠脾細胞的同種增殖能力無明顯降低;治療鼠載瘤實驗的成瘤時間、

7、腫瘤生長曲線以及腫瘤組織中CD3+T淋巴細胞的浸潤等與對照組無明顯差異。
　　3)以C57BL/6鼠(H-2Kb)和bml鼠(H-2Kbm1)為皮膚移植的供受體。兩者的遺傳背景只有H-2Kb抗原上三個氨基酸的差異。這種移植模型將能最大限度地凸顯H-2Kb同種反應性T細胞的清除或抑制對移植排斥的影響。在皮膚移植術后第7、9、11天經(jīng)尾靜脈分別注射KaAPC、anti-Fas PLGA、Blank PLGA或PBS進行分組治療，然后:

8、在移植術后第14天取各組脾細胞，CFSE標記后，在體外與第三方BALB/c鼠的脾細胞行單向混合淋巴細胞培養(yǎng)3天和7天，流式分析各組治療鼠CD3+T和CD8+T細胞群的同種反應增殖能力;皮膚移植術后第3天皮下注射B16黑色素瘤細胞，而后分組治療，并每天測量腫瘤大小，第23天時殺鼠取腫瘤組織，稱重，制冰凍切片后APC-anti-mouse CD3以及FITC-anti-mouse CD8單抗染色;在第11天選部分鼠取脾臟細胞用CFSE標記，

9、與Yac-1淋巴瘤細胞混合培養(yǎng)4-5h，后用7-AAD染色死亡細胞，流式分析NK細胞的殺瘤活性;在第9、11、13天各選部分鼠取脾臟細胞，用APC-anti-CD3、FITC-AnnexinⅤ和PI做三色熒光染色，流式分析各組CD3+T細胞群中凋亡T細胞的比例及脾臟中T細胞的頻率;在第9和13天各選部分鼠取眼眶周圍血，經(jīng)血液分析儀行血常規(guī)分析。結果顯示:KaAPC治療組皮膚移植物的中位存活時間比對照組延長24.3-27.3天;治療鼠中，

10、脾臟T細胞在體外對第三方小鼠脾細胞的同種增殖能力無明顯降低:移植瘤的成瘤時間、腫瘤生長曲線以及腫瘤組織中CD3+T和CD8+T細胞的浸潤等與對照組無明顯差異;脾臟NK細胞的殺瘤能力亦無顯著下降;在第三次治療后（即第13天），脾臟T細胞群中凋亡細胞的比例顯著高于對照組，T細胞頻率則顯著低于對照組;在第三次治療后，外周血中性粒細胞比例較對照組顯著降低，單核細胞和淋巴細胞的數(shù)量則無明顯下降。
　　4)利用雙乳化劑揮發(fā)法成功制備了表面功能

11、化的、直徑為450nm以及200nm的PLGA納米球，具有良好的表征:呈規(guī)則球形，表面完整;平均Zeta電位為36.2mV+5.00mV左右;共包被H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗后制成兩種直徑的納米級KaAPC，經(jīng)PE-anti-H-2Kb單抗和FITC-anti-hamster IgG單抗免疫熒光染色分析證實其表型正確;在C57BL/6(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)為供受對的皮膚移植模型中，直徑為450nm