殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的初步研究.pdf

1、多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性脫髓鞘性疾病，主要病理改變?yōu)榇竽X半球的側(cè)腦室旁、腦干以及脊髓處髓鞘脫失，并有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤?，F(xiàn)已普遍認(rèn)為該病主要是由自身反應(yīng)性T細(xì)胞所介導(dǎo)的針對CNS髓鞘自身抗原的自身免疫病，其中CD4+T細(xì)胞在MS中其關(guān)鍵作用，CD8+T細(xì)胞也有一定致病性。目前的免疫抑制藥物都不能有效治愈MS，有時(shí)患者還會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)欠佳或不能耐受，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。選擇性

2、清除或抑制同種反應(yīng)性T細(xì)胞是治療自身免疫病等的理想策略之一，因?yàn)樗鼙苊饷庖咭种苿┧鶎?dǎo)致的患者整體免疫功能損傷。因此，幾十年來人們一直在探索各種特異性免疫療法，殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞(Killer artificialantigen-presenting cell，KaAPC)就是其中之一。KaAPC是利用基因工程的方法使現(xiàn)有的抗原提呈細(xì)胞表面表達(dá)Fas配體，并通過細(xì)胞膜上的pMHC分子靶向結(jié)合抗原特異性T細(xì)胞，同時(shí)通過膜上的FasL與

3、活化后T細(xì)胞膜上的Fas分子結(jié)合從而誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。這種策略對同種移植排斥、自身免疫病及變態(tài)反應(yīng)等的治療都有很多成功的報(bào)道。近年來人們開始使用非細(xì)胞性載體，如磁珠、膠乳微球等制備KaAPC。其基本原理是以pMHC多聚體為靶向抗原，與anti-Fas共包被細(xì)胞大小的磁珠或膠乳微球，在體外靶向殺傷抗原特異T細(xì)胞。本課題組前期利用可在人體內(nèi)生物降解、無毒性、有組織相容性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic

4、acid，PLGA)微球制備KaAPC，在體外和皮膚移植鼠體內(nèi)成功實(shí)施了抗原特異性T細(xì)胞的靶向殺傷，有效延緩?fù)N皮膚移植物的成活期。
　　實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)是研究多發(fā)性硬化的理想動(dòng)物模型。本研究利用PLGA微球共吸附以裝載有MOG兩種抗原表位的H-2Db/MOG40-54二聚體和H-2 I-Ab/MOG35-55多聚體，同時(shí)共價(jià)偶聯(lián)

5、三種T細(xì)胞反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)分子（anti-Fas mAb、PD-L1-Ig、TGF-β1）和抗吞噬分子（CD47-Ig），制備多功能的新型KaAPCs，初步研究其治療小鼠EAE的效果。
　　結(jié)果:
　　1)用21只6-8周雌性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為3組，即PBS組、BCG組和MOG組，9只/組。將MOG35-55多肽與完全弗氏佐劑CFA等體積混合后充分乳化(BCG最終濃度10mg/ml)，皮下多點(diǎn)注射MOG組小鼠（MOG4

6、00μg/0.2ml/只）;PBS組和BCG組則分別用PBS和BCG代替MOG多肽，同樣行皮下多點(diǎn)注射。同時(shí)，在第0天，BCG組和MOG組每只小鼠經(jīng)腹腔注射0.2mlPTX（500ng/只），并在48小時(shí)后重復(fù)注射一次。結(jié)果顯示，MOG組所有小鼠從造模第7天后陸續(xù)發(fā)病，至第11天為發(fā)病初期，第18天為發(fā)病高峰，至第40天為慢性期;HE染色顯示腦和脊髓多區(qū)域炎性細(xì)胞在發(fā)病初期明顯增加，高峰期最多;免疫組化顯示MBP蛋白從發(fā)病初期即開始減少

7、，至發(fā)病高峰期最少;GFAP蛋白則相反，發(fā)病初期陽性細(xì)胞增多，高峰期最多，慢性期趨于平穩(wěn);流式檢測顯示:淋巴結(jié)中MOG35-55特異性CD4+T細(xì)胞頻率和MOG40-54特異性CD8+T細(xì)胞頻率在發(fā)病初期增高，高峰期最高，慢性期次之;ELISPOT顯示:脾細(xì)胞群中對MOG35-55和MOG40-54多肽刺激有反應(yīng)活性的T細(xì)胞頻率在發(fā)病初期最高，高峰期次之，慢性期最低，與病程中特異性CD4+T和CD8+T的數(shù)量水平不一致。
　　2)

8、利用雙乳化劑揮發(fā)法成功制備了表面功能化的、直徑4.5μm的PLGA微球。掃描電鏡、Zeta電位和粒徑分析顯示其具有良好的表征:呈規(guī)則球形，表面完整，61.2％的微球直徑在4.0-5.0μm，平均Zeta(ξ-)電位為36.3mV+6.11 mV，分散性好，表面氨基基團(tuán)豐富;單抗染色和流式分析證實(shí):所制備的KaAPCs成功共展示了相應(yīng)的H-2Db-Ig二聚體和H-2I-Ab-Ig多聚體、anti-Fas及其他分子，微球表面的分子表型正確。

9、
　　3)將制備好的KaAPCs輸注治療小鼠EAE模型，在發(fā)病的第11天，第14天和第17天分別給予KaAPCs尾靜脈注射，每次1×107 PLGA/ml/只。初步臨床觀察和神經(jīng)功能評分顯示:KaAPCs治療組小鼠在第三次治療后開始出現(xiàn)明顯的臨床緩解癥狀，其他PBS治療組、空白PLGA治療組和無關(guān)抗原肽特異性KaAPCs治療組均未出現(xiàn)癥狀減輕跡象，初步提示KaAPCs治療EAE的有效性。
　　結(jié)論:
　　成功制備EAE