角質(zhì)形成細胞抗原提呈功能研究.pdf

1、角質(zhì)形成細胞（KCs）為皮膚表皮的主要組成細胞，是機體直接與外界環(huán)境接觸，最先接觸外來抗原的細胞。研究發(fā)現(xiàn)，KCs不僅形成機體的物理屏障，同時具有重要的免疫功能。KCs在一些疾病的狀態(tài)下或者直接受到干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子的刺激后，可以表達抗原提呈相關分子如主要組織相容性復合體-II（MHC-II）、細胞間粘附分子-1（ICAM-1）等，同時主要組織相容性復合體-I（MHC-I）也會較刺激前增高。上述改變使得KCs具備了發(fā)揮抗

2、原提呈功能的先決條件。
　　以往的研究僅僅證明活化后的KCs具備了發(fā)揮抗原提呈的條件，如表達一些專職抗原提呈細胞（professional APC）所特有的分子，或者利用動物實驗間接證明了KCs發(fā)揮了抗原提呈的功能，但均未能拿出有說服力的直接證據(jù)。本研究通過利用流式細胞學、免疫共沉淀、質(zhì)譜鑒定、Elispot等實驗直接證明了KCs在活化狀態(tài)下可以作為APC發(fā)揮抗原提呈功能。
　　目的：證明KCs在特定條件下可以發(fā)揮抗原提呈功

3、能，鑒定KCs提呈抗原肽的序列及其MHC限制性。
　　方法：
　　1.刺激HaCaT細胞表達抗原提呈相關分子：用細胞因子IFN-γ刺激人永生化角質(zhì)形成細胞系（HaCaT細胞）致使其活化；
　　2.質(zhì)譜鑒定抗原肽：分別利用MHC-I、MHC-II單克隆抗體對活化后HaCaT細胞胞漿及包膜表面的主要組織相容性復合體-肽段復合物（MHC-peptide complex）進行免疫共沉淀（Co-IP），用PH3.0的酸液對共沉淀

4、下來的MHC-肽段復合物進行解離，后經(jīng)超濾管離心將兩者分離，通過銀染及蛋白印跡（Western blot）來驗證免疫共沉淀的特異性，質(zhì)譜判定MHC上所加載的肽段及其蛋白來源；
　　3.共孵育實驗：檢測HaCaT細胞 MHC-I和MHC-II每個基因座分型，根據(jù)質(zhì)譜鑒定的肽段結(jié)果預測目的MHC等位基因；流式細胞術分選7例銀屑病病人外周血CD4+T細胞及CD8+T細胞，將IFN-γ刺激或未刺激HaCaT細胞分別與分選的T細胞共孵育，酶

5、聯(lián)免疫斑點測定法（Elispot）觀察T細胞活化情況；4. MHC限制性驗證：測序鑒定上述共孵育實驗陽性患者MHC分型，與肽段預測結(jié)果比對，驗證KCs抗原提呈的MHC限制性。
　　結(jié)果：HaCaT細胞受到IFN-γ刺激后膜表面出現(xiàn)MHC-II、ICAM-1的表達，MHC-I表達較刺激前增高，且隨著IFN-γ刺激濃度及時間的增加，MHC-I、MHC-II的表達呈劑量和時間依賴性增高。在保證抗原提呈相關分子表達較高及HaCaT細胞狀態(tài)

6、較佳的情況下，選取了IFN-γ最佳刺激濃度及刺激時間（400U/ml,48h）。Co-IP實驗及質(zhì)譜分析結(jié)果顯示：銀染及Western blot證實MHC抗體可以特異性地沉淀出MHC蛋白。質(zhì)譜成功鑒定出MHC上加載肽段及其蛋白來源，包括來自胞內(nèi)的角蛋白、核糖體蛋白、組蛋白等。無刺激的或IFN-γ刺激的HaCaT細胞分別與7例銀屑病病人的 CD4+T細胞及CD8+T細胞共孵育后發(fā)現(xiàn)，IFN-γ刺激后的 HaCaT細胞可以使1例銀屑病病人的

7、CD4+T細胞活化，無IFN-γ刺激組的CD4+T細胞及CD8+T細胞均未活化。
　　結(jié)論：KCs經(jīng)IFN-γ刺激后可以表達專職APC如樹突狀細胞（DCs）、巨噬細胞（MΦ）、B淋巴細胞（B cells）所特有的MHC-II、ICAM-1等分子，MHC-I表達也較刺激前明顯增高，說明刺激后的KCs具備了發(fā)揮抗原提呈的條件。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明IFN-γ刺激后，KCs的MHC-I、MHC-II抗原結(jié)合槽中加載了肽段。共孵育實驗說明活化后