Notch信號途徑對小鼠樹突狀細胞抗原提呈功能和Th1-Th2偏轉(zhuǎn)潛能的影響.pdf

1、樹突狀細胞（Dendriticcell，DC)是專職抗原提呈細胞，其對免疫系統(tǒng)強有力的調(diào)節(jié)作用為腫瘤治療開辟了新的途徑。DC疫苗是指負載腫瘤抗原的DC，其能在患者體內(nèi)誘發(fā)抗原特異性的T細胞反應進而殺死腫瘤細胞。在DC的分化和發(fā)揮功能過程中，Notch信號途徑是必須的。文獻報道Notch配體Jagged-1能對DC的分化起抑制作用。而我們利用過表達Notch配體DLL1（Delta-like1）的OP9基質(zhì)細胞與野生型小鼠骨髓細胞共培養(yǎng)誘

2、導生成DC，觀察DLL1對DC分化和對其負載EL4淋巴瘤抗原后的提呈功能的影響，以期在DC誘導分化過程中，通過調(diào)節(jié)Notch信號產(chǎn)生更有效的DC腫瘤疫苗。
　　DC通過模式識別受體，如TLR來識別病原體，進而與T細胞發(fā)生相互作用并影響T輔助細胞向Th1或Th2極化。具有誘發(fā)Th1反應潛能的DC被命名為DC1；而能誘發(fā)Th2反應的則被稱為DC2。胞內(nèi)菌感染引發(fā)以分泌IFN-γ為特征的Th1反應，而寄生蟲感染觸發(fā)以分泌IL-4、IL-

3、5和IL-13為特征的Th2反應。TLR信號能激活NF-κB途徑。多項研究報道Notch信號途徑對NF-κB起調(diào)控作用。我們前期實驗結果顯示在GM-SCF和IL-4存在情況下，RBP-J敲除小鼠骨髓細胞生成的DC數(shù)量較少且樹突少。并且，RBP-J-/-DC的表面分子MHCⅡ的表達量較低，抗原提呈功能較弱。本實驗中，我們用LPS或PolyI:C刺激RBP-J+/-DC和RBP-J-/-DC，檢測其Notch配體表達水平、細胞因子分泌量和與

4、之相互作用的T細胞極化情況。文獻報道這些Notch配體的轉(zhuǎn)錄受NF-κB的調(diào)控。因此，我們可以推測DC表面Notch配體表達水平是TLR、NF-κB和Notch共同調(diào)控的結果。
　　我們已取得如下實驗結果：
　　1.在GM-CSF和IL-4存在的情況下，野生型小鼠骨髓細胞與OP9-DLL1或OP9-GFP共培養(yǎng)8天。與OP9-GFP組相比，和OP9-DLL1共培養(yǎng)生成的DC數(shù)量更多。
　　2.我們使用流式細胞儀檢測成熟

5、DC表面分子的表達情況。和OP9-DLL1共培養(yǎng)生成的DC經(jīng)EL4腫瘤抗原刺激成熟后，其表面MHCⅡ、共刺激分CD80和CD86表達量更高。
　　3.使用ELISA試劑盒檢測DC經(jīng)EL4腫瘤抗原刺激成熟后細胞因子分泌水平。OP9-DLL1組DC分泌更多的IL-12，而IL-10的分泌量卻較少。
　　4.與OP9-DLL1共培養(yǎng)得到的DC負載腫瘤抗原后，與靜息狀態(tài)的T細胞共孵育。通過流式細胞儀檢測，DLL1組的T細胞具有更強的

6、擴增能力。
　　5.從PolyI:C誘導的RBP-J敲除的小鼠中得到骨髓細胞并按上述同樣方法誘導其分化成DC。我們使用Real-timePCR檢測經(jīng)LPS或PolyI:C刺激成熟的DC表面Notch配體的mRNA表達水平。LPS與TLR4結合能上調(diào)DC表面Jagged-1，Delta-like1和Delta-like4的表達水平。并且，RBP-J-/-DC上這三種Notch配體上調(diào)程度低于RBP-J+/-DC。而這兩種DC經(jīng)LPS

7、刺激后，其他配體Jagged-2和Delta-like3表達情況沒有明顯差別。PolyI:C刺激DC后產(chǎn)生相似結果。
　　6.經(jīng)LPS或PolyI:C作用后，與RBP-J+/-DC相比，RBP-J-/-DC分泌較多的IL-10和較少的IL-12。但是IL-6和TNF-α的分泌量卻沒有明顯區(qū)別。
　　7.我們使用流式胞內(nèi)染色法和ELISA試劑盒檢測靜息狀態(tài)T細胞與RBP-J+/-DC或RBP-J-/+DC相互作用后細胞因子的分

8、泌量。兩種檢測結果均顯示：與RBP-J+/-DC共孵育的T細胞分泌較多的IFN-γ；而RBP-J-/-DC能使T細胞產(chǎn)生較多的IL-4。
　　8.在DC與T細胞共孵育的第三天和第五天，通過流式細胞儀檢測T細胞的增殖能力。與RBP-J+/-DC組相比，RBP-J-/-DC組的T細胞擴增能力較弱。
　　綜上所述，Notch配體DLL1能促進小鼠骨髓細胞向DC分化并且增強其抗原提呈功能。刺激物與TLR結合使DC具有影響Th1或Th