一種模擬血管微環(huán)境的藥物篩選模型的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、藥物研發(fā)是一個(gè)非常耗費(fèi)時(shí)間、人力和物力的過(guò)程,雖然很多先導(dǎo)候選藥物在體外有很好的藥理活性,但當(dāng)它們進(jìn)入動(dòng)物或者臨床試驗(yàn)的時(shí)候,都表現(xiàn)出很低的生物活性,甚至出現(xiàn)了一些顯著的副作用,因此大多數(shù)新候選藥物都在臨床試驗(yàn)中被淘汰。體外與體內(nèi)藥物代謝的微環(huán)境之間存在的差異,很有可能是導(dǎo)致化合物在體外表現(xiàn)出很好的效果、而在體內(nèi)卻沒(méi)有顯著效果的重要原因。
　　基于此,本課題建立了一種可以模擬血管微環(huán)境的藥物篩選模型,以提高藥物篩選的效率。血管發(fā)生

2、病變的部位,血管壁主要受到低剪切力或震蕩剪切力的作用,而血管壁的平滑肌可與內(nèi)皮細(xì)胞形成血管肌-內(nèi)皮縫隙連接,實(shí)現(xiàn)電信號(hào)和小分子物質(zhì)的相互傳遞,對(duì)血管的生理和病理狀態(tài)有重要的影響。因此為了模擬血管病變部位的微環(huán)境,我們?cè)O(shè)計(jì)和建立了一種可以提供低剪切力,并且能實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的流動(dòng)腔。首先,對(duì)流動(dòng)腔進(jìn)行了流體數(shù)值模擬分析。然后,建立了模擬血管微環(huán)境的藥物篩選模型,并選擇內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)指數(shù)和凋亡率、血小板衍生生長(zhǎng)因子、超氧化物歧化

3、酶、丙二醛、平滑肌細(xì)胞的遷移率作為驗(yàn)證模型有效性的指標(biāo),選擇臨床藥物曲匹地爾和丹參作為模型藥物。最后,利用該模型對(duì)丹參提取物中,具有抗血管疾病的活性物質(zhì)進(jìn)行了篩選,通過(guò)與傳統(tǒng)的藥物篩選模型進(jìn)行對(duì)比,更進(jìn)一步驗(yàn)證了我們所建立的藥物篩選模型的有效性,并且由于該模型在體外模擬了血管的微環(huán)境,因此有助于提高藥物篩選的效率,具有為藥物研發(fā)節(jié)約時(shí)間和成本的潛在優(yōu)勢(shì)。
　　本課題的主要研究?jī)?nèi)容和相應(yīng)結(jié)果如下:
　?、僭O(shè)計(jì)了一種可以提供低剪

4、切力,并能滿足細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的流動(dòng)腔,作為模擬血管微環(huán)境的載體。利用Fluent6.3軟件對(duì)不同長(zhǎng)度的流動(dòng)腔(100mm、90mm、80mm、70mm和60mm)內(nèi)部的流體狀態(tài)進(jìn)行了數(shù)值模擬。結(jié)果表明,隨著流動(dòng)腔長(zhǎng)度逐漸縮短,細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域流體的速度和剪切力波動(dòng)逐漸增大。當(dāng)流動(dòng)腔長(zhǎng)度為70mm時(shí),剪切力大小在4dyn/cm2-6.5dyn/cm2范圍內(nèi),細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域的剪切力出現(xiàn)了兩個(gè)峰值,這可能是通道中再循環(huán)渦流處的高流速梯度導(dǎo)致。因此,為

5、了在體外模擬振蕩低剪切力的情況,我們選擇70mm的流動(dòng)腔長(zhǎng)度進(jìn)行后期的實(shí)驗(yàn)。
　?、诮⒘四M血管微環(huán)境的藥物篩選模型,該模型由流動(dòng)腔、恒流泵和儲(chǔ)液瓶構(gòu)成。流動(dòng)腔可以為內(nèi)皮細(xì)胞提供一個(gè)與血管損傷部位相似的低剪切力,流動(dòng)腔內(nèi)聯(lián)合培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞通過(guò)半透膜進(jìn)行物質(zhì)和信息的傳遞,該模型很好地模擬了體內(nèi)血管的微環(huán)境。考察了不同大小的剪切力(1dyn/cm2、2dyn/cm2、4dyn/cm2、6dyn/cm2、8dyn/cm2和

6、10dyn/cm2)和作用時(shí)間(6h、12h和24h)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞活性的影響。結(jié)果表明,當(dāng)剪切力為4dyn/cm2且作用了12h后,內(nèi)皮細(xì)胞活性顯著下降了25％左右,而平滑肌細(xì)胞活性顯著增加了10％左右,該結(jié)果與文獻(xiàn)的報(bào)道一致。因此,選擇4dyn/cm2大小的剪切力和12h的作用時(shí)間來(lái)建立藥物篩選模型。
　?、弁ㄟ^(guò)考察同心血管疾病相關(guān)的一些重要指標(biāo)(內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和凋亡率、平滑肌細(xì)胞的遷移率、細(xì)胞產(chǎn)生的血小板衍生生長(zhǎng)因子

7、、超氧化物歧化酶和丙二醛的含量)在藥物篩選模型中的變化,以及考察抗心血管疾病藥物(曲匹地爾和丹參提取物)在該模型中的作用,驗(yàn)證了藥物篩選模型的有效性。與正常條件下的共培養(yǎng)細(xì)胞相比,藥物篩選模型中,內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了損傷性的變化,細(xì)胞形態(tài)指數(shù)增加至0.86,細(xì)胞凋亡率顯著增高達(dá)到20.40％;平滑肌細(xì)胞的遷移率為正常條件下的1.8倍;血小板衍生生長(zhǎng)因子和丙二醛的產(chǎn)生量分別增加至14.5ng/mL和1.47nmol/mg蛋白質(zhì);超氧化物歧

8、化酶的含量顯著降低至21.46U/mg蛋白質(zhì)。將曲匹地爾作用于藥物篩選模型后,內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)得到了很好的修復(fù),細(xì)胞的形態(tài)指數(shù)恢復(fù)至0.64,也顯著地抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,血小板衍生生長(zhǎng)因子的含量顯著降低,但是超氧化物歧化酶和丙二醛的含量沒(méi)有顯著變化。將丹參提取物作用于藥物篩選模型后,內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)也得到了很好的修復(fù),細(xì)胞的形態(tài)指數(shù)恢復(fù)至0.71,也顯著地抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)了超氧化物歧化酶的生成且抑制了丙二醛的生成,但是血小板衍生

9、生長(zhǎng)因子的含量沒(méi)有顯著變化。通過(guò)對(duì)這些指標(biāo)的檢測(cè),以及和正常條件下細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比分析,證明了我們所建立的藥物篩選模型成功地模擬了血管的病理狀態(tài),藥物在模型中能很好的發(fā)揮其藥理藥效作用,并且藥物在該模型中的藥理作用與臨床上研究報(bào)道的藥理作用相符,證明了藥物篩選模型的有效性。
　　④利用該模擬血管微環(huán)境的藥物篩選模型對(duì)丹參提取物中抗心血管疾病的活性成分進(jìn)行篩選,并與傳統(tǒng)的藥物篩選模型(H2O2氧化損傷模型)進(jìn)行了對(duì)比。高效液相色譜分析表

10、明,丹參提取物原液中有19個(gè)主峰,通過(guò)保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)物法,推斷出其中的9個(gè)成分,包括丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、隱丹參酮亞甲基丹參醌和丹參酮IIA。傳統(tǒng)的藥物篩選模型篩選到15種化合物,包括所有丹參提取物原液中定性的9種成分,而模擬血管微環(huán)境的藥物篩選模型僅篩選到9種化合物,其中包括丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮和丹參酮IIA,這五種物質(zhì)都具有抗心血管疾病的效果。然而,利用傳統(tǒng)的藥物模型篩選到的一