基于模擬微血流狀設(shè)計(jì)藥物篩選模型的初步研究.pdf

1、近十幾年來新藥的數(shù)量呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，面對(duì)著周期長(zhǎng)、成本高且成功率低的迫切問題，何種策略對(duì)新藥研發(fā)是行之有效的，一直是個(gè)爭(zhēng)論不休的話題。盡管有大量的活性物質(zhì)在體外篩選中被發(fā)現(xiàn)，然而令人費(fèi)解的是很多在體外藥理活性高的化合物一旦在進(jìn)入動(dòng)物或臨床試驗(yàn)后往往藥效差強(qiáng)人意，這也就導(dǎo)致了許多候選藥物在后期研發(fā)中被淘汰。然而，引起這種活性差異的原因仍然是一個(gè)“黑匣子”，這也成為了現(xiàn)代藥物研發(fā)中關(guān)注的焦點(diǎn)，是值得我們深入探究的問題。
　　

2、藥物在體外篩選與體內(nèi)發(fā)揮作用的真實(shí)環(huán)境差異可能是其中的原因之一，一個(gè)最明顯區(qū)別就是體外的靜態(tài)篩選與體內(nèi)的動(dòng)態(tài)環(huán)境之差。藥物進(jìn)入體內(nèi)一般會(huì)經(jīng)過吸收、分布、代謝等過程來發(fā)揮作用，然而這些過程都與血液循環(huán)系統(tǒng)密切相關(guān)，特別是微循環(huán)系統(tǒng)作為機(jī)體進(jìn)行物質(zhì)交換的場(chǎng)所，它是否在引起這種體內(nèi)外藥物活性差異中扮演著什么重要角色?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，丹參為模型藥物，借助于流動(dòng)腔加載以實(shí)現(xiàn)模擬在體微血流的流動(dòng)環(huán)境，擬初步建立一種動(dòng)態(tài)的藥物篩選

3、方法，以考察動(dòng)態(tài)篩選與靜態(tài)篩選之間是否存在細(xì)胞對(duì)藥物吸收和代謝的差異。生物力學(xué)及生物力藥理學(xué)的迅速發(fā)展為提出一種新的動(dòng)態(tài)篩選策略提供了強(qiáng)大的理論依據(jù)。
　　 本課題的主要研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下所示：
　　 ①基于在體微血管的生理環(huán)境(1～5dyn/cm2剪切力直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞)，建立了一套體外模擬微血流的系統(tǒng)，由平板流動(dòng)腔、恒流泵、硅膠管和儲(chǔ)液瓶構(gòu)成。該系統(tǒng)能提供二維穩(wěn)定的分散狀層流。通過對(duì)流動(dòng)系統(tǒng)的校正，得到恒流泵各

4、轉(zhuǎn)速與對(duì)應(yīng)的流體流量之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.999。采用烏氏粘度計(jì)測(cè)得灌流液在37℃下的粘度為6.684x10-3dyn·s/cm2，并根據(jù)剪切力公式，擬合恒流泵各轉(zhuǎn)速與對(duì)應(yīng)剪切力之間良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.999。并推算出實(shí)驗(yàn)所需的微血流剪切力τ=1.5 dyn/cm2，3.0 dyn/cm2和4.5dyn/cm2時(shí)，對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)速分別為0.18rpm，0.28rpm和0.38rpm。
　　 ②以丹參提取

5、物作為模型藥物，考察了不同濃度的丹參提取物(15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明100μg/mL～400μg/mL對(duì)細(xì)胞活力有顯著影響，并在100μg/mL達(dá)到最大活力119.50％，相對(duì)于正常對(duì)照組活力提高了19.50％。將丹參提取物原液進(jìn)行LC-MS分析，發(fā)現(xiàn)12個(gè)物質(zhì)峰，通過分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)及參考丹參成分的相關(guān)文獻(xiàn)，從中推斷出11個(gè)成分

6、，包括丹參素、丹酚酸A、丹酚酸J、咖啡酸、二氫丹參酮Ⅰ、丹酚酸B、迷迭香酸甲酯、丹酚酸D、原兒茶醛、亞甲基丹參醌和迷迭香酸，以及一個(gè)未知成分。通過對(duì)給藥后靜態(tài)模型和動(dòng)態(tài)模型的細(xì)胞解離液進(jìn)行LC-MS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們都對(duì)丹參素、二氫丹參酮Ⅰ、咖啡酸、丹酚酸B、亞甲基丹參醌、丹酚酸D和丹酚酸A這7個(gè)成分有吸收，這些成分可能與血管活性的功效有關(guān)；另外，與靜態(tài)模型相比，在動(dòng)態(tài)模型的細(xì)胞解離液中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)未知成分峰，通過與空白細(xì)胞解離液和藥材原液譜

7、圖比較均未發(fā)現(xiàn)，推測(cè)其可能是藥物與細(xì)胞在微血流條件下作用后產(chǎn)生的某種代謝物。在微血流的給藥時(shí)間梯度(1h、2h、3h)考察下，動(dòng)態(tài)模型均對(duì)這7個(gè)成分有吸收，而且在不同加載時(shí)間的作用下于不同時(shí)間各出現(xiàn)一個(gè)未知成分峰，通過譜圖對(duì)比，推測(cè)這些未知成分可能為代謝物。由此可見，相對(duì)于靜態(tài)細(xì)胞模型來說，在微血流擬態(tài)下，細(xì)胞對(duì)藥物的吸收代謝是有影響的，并且隨著藥物作用時(shí)間的增加，對(duì)其吸收代謝會(huì)產(chǎn)生不同的影響。
　　 ③通過考察靜態(tài)模型(τ=0

8、)、恒流模型(τ=1.5dyn/cm2)和梯度流模型(τ=1.5-3.0-4.5 dyn/cm2)三種不同給藥情況下，細(xì)胞對(duì)藥物吸收代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們均對(duì)丹參提取物中的7個(gè)成分有吸收，包括丹參素、二氫丹參酮Ⅰ、咖啡酸、丹酚酸B、亞甲基丹參醌、丹酚酸D和丹酚酸A。然而在恒流模型中出現(xiàn)1個(gè)未知成分峰，在梯度流模型的細(xì)胞解離液中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)未知成分峰，通過與空白細(xì)胞解離液和藥材原液譜圖比較均未發(fā)現(xiàn)，推測(cè)這些未知成分可能為藥物與細(xì)胞在微血流

9、條件下作用后產(chǎn)生的某種代謝物，而靜態(tài)模型沒有未知成分峰的出現(xiàn)。由此可推斷，與靜態(tài)相比較，在微血流條件下動(dòng)態(tài)的藥物篩選環(huán)境會(huì)影響細(xì)胞對(duì)藥物的吸收代謝，并且梯度流的剪切力這種影響作用更明顯。
　　 ④通過考察H2O2不同濃度(75μmol/L、150μmol/L、300μmol/L、600μmol/L、1200μmol/L)作用于內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間(0.5h、1h、2h)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2300μmol/L～1200μmol/L讓細(xì)胞

10、活性明顯下降，與正常對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.05)，其中300μmol/L的H2O2刺激0.5h，細(xì)胞活性抑制率達(dá)到27.94％，以此建立氧化損傷模型。在一定的實(shí)驗(yàn)濃度范圍，考察了不同濃度的丹參提取物(15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化效應(yīng)，研究表明200μg/mL的丹參提取物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用最強(qiáng)，細(xì)胞活性達(dá)到了113.64％?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)，

11、在微血流擬態(tài)下觀察到經(jīng)200μg/mL丹參提取物預(yù)處理后再與H2O2作用的細(xì)胞，其形態(tài)比損傷組有較明顯的改善，說明動(dòng)態(tài)模型篩選丹參中抗氧化活性成分是可行的，并且丹參提取物在動(dòng)態(tài)和靜態(tài)培養(yǎng)下對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用還是有差異的。在動(dòng)態(tài)模型下，從細(xì)胞解離液中，分析鑒定出5個(gè)丹參活性成分，包括丹參素、丹酚酸B、丹酚酸D、咖啡酸、二氫丹參酮Ⅰ，和2個(gè)未知成分峰；而靜態(tài)模型中，只有4個(gè)成分被細(xì)胞吸收，比動(dòng)態(tài)少了二氫丹參酮Ⅰ的吸收和1個(gè)未知成分峰，通過與空