核黃素光化學作用滅活血液及血制品中的淋巴細胞及病原微生物的研究.pdf

1、背景輸血是現代醫(yī)學不可或缺的重要支撐條件,且隨著臨床醫(yī)療技術的發(fā)展和社會老齡化程度的提高,其重要性必然隨之進一步突顯；但另一方面輸血亦和多數臨床治療方法一樣,存在著一定的不良反應,受血者遭遇輸血不良反應的可能性稱為輸血風險。雖隨著輸血相關管理和技術措施的改進,輸血風險的發(fā)生幾率已大幅度降低,但由于輸血治療覆蓋面廣、使用量大,其個案累計絕對數仍相當大,因此,如何在確保臨床輸血療效的同時防范輸血風險一直是世界衛(wèi)生組織、各國衛(wèi)生行政部門和醫(yī)學

2、界共同關注的熱點問題。 輸血風險主要由感染性輸血風險和免疫性輸血不良反應兩大類構成。艾滋病病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等多種病毒及某些細菌、原蟲等諸多病原微生物可通過輸血途徑傳播而構成感染性輸血風險；輸血相關移植物抗宿主病(TA-GVHD)則是后果最為嚴重的免疫性輸血風險,一旦罹病,其死亡率高達90％以上。血液成分病原體滅活是杜絕感染性輸血風險的關鍵技術,核黃素光化學法(Riboflavin p

3、hotochemical treatment,RPT)是近年來在血液成分病原微生物滅活研究領域中被密切關注方法,其有效性和安全性已得到證實。現知核黃素能與核酸結合,在光能作用下所發(fā)生的后續(xù)反應可導致核酸斷裂并阻止核酸復制,由于這一原理在邏輯上亦適用于血液制品中淋巴細胞的滅活,因而引起了有關研究者的興趣。用RPT方法滅活T淋巴細胞以預防TA-GVHD研究的預期目標是建立一種事半功倍、能同時滅活病原微生物和淋巴細胞的方法,以簡化血液安全處理

4、的程序,避免反復處理對血液成分造成的不良影響。核黃素作為一種人體所必需的維生素,具有對人體無害的特點。 目的本研究中擬用400nm～500nm波段的可見光替代目前多數研究中使用的紫外光源,減少光源本身對血液成分的不良影響,研究該波段光源所激發(fā)的核黃素光化學反應對淋巴細胞,細菌,病毒的滅活作用,并對其滅活病原體的機理進行探討分析。 方法將含有淋巴細胞或者細菌、病毒的培養(yǎng)液輸注入血袋中,再加入核黃素溶液,核黃素終濃度為100

5、umol/L,混勻后將血袋放在控溫光照儀中,從血袋上下兩側照射,照射劑量為8.0J/ml～32.0J/ml,照射時溫度為4℃。照射后標本通過淋巴細胞存活趨勢,增殖抑制率,細胞周期,細胞因子分泌量,細胞形態(tài)變化,細胞凋亡及核酸損傷等檢測,分析核黃素光化學作用滅活淋巴細胞的效果和機理；通過大腸桿菌培養(yǎng),電鏡觀察,核酸檢測分析核黃素光化學作用滅活大腸桿菌的效果和機理；通過病毒滴度檢測(細胞病變法),電鏡觀察和核酸檢測分析核黃素光化學作用對si

6、ndbis病毒的滅活效果和機理。結果可見光激發(fā)下的核黃素光化學作用可抑制淋巴細胞增殖,使淋巴細胞在形態(tài)和功能上都失去增殖特征,導致淋巴細胞死亡。實驗組淋巴細胞對PHA和CD3單抗刺激后的增殖抑制率分別達(99.01±1.30)％和(99.14±1.00)％；EPT可阻止淋巴細胞進入細胞增殖周期和細胞因子分泌,經PHA刺激后,實驗組淋巴細胞細胞因子IL-1β,IL-2,IL-6,IL-8,TNF-α和IFN-γ分泌量受到抑制分別達95.0

7、9％±2.60％,98.20％±1.64％。98.77％±0.97％,92.30％±11.04％,98.82％±1.42％和100％,經CD3單抗和CD28單抗刺激后,實驗組淋巴細胞細胞因子IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α,IFN-Y分泌量受到抑制達89.13％±14.73％,99.02％±0.72％,94.35％±4.93％,84.41％±19.55％和100％；核黃素光化學作用滅活后的淋巴細胞線粒體和內質網腫脹破裂,細胞核

8、聚縮,無DNA ladder出現,未檢測到磷脂酰絲氨酸發(fā)生外翻,無caspase-3蛋白表達,bax基因轉錄量未增加,bcl-2基因轉錄未降低,細胞DNA嚴重損傷,導致一部分淋巴細胞在滅活過程中死亡,另一部分淋巴細胞滅活后進入無序壞死直至死亡。相同波段內,核黃素光化學作用可以有效滅活大腸桿菌和sindbis病毒分別達6log和5log,使大腸桿菌和sindbis病毒的核酸受到損傷,影響核酸的復制,導致大腸桿菌和sindbis病毒的死亡。