河南省漯河地區(qū)和黑龍江省肇東地區(qū)自然人群乙型肝炎病毒分子流行病學(xué)初步分析.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)慢性感染是全球性的健康問題。全世界共有3.5億慢性HBV感染者，其中75％為亞洲人。 我國流行的HBV基因型主要為C型和B型。河南省漯河地區(qū)和黑龍江省肇東地區(qū)均屬于HBV低度流行地區(qū)，本研究在2005年HBV感染的調(diào)查基礎(chǔ)上研究兩地區(qū)HBV基因型的流行情況和HBV BCP區(qū)和前C區(qū)的變異情況，為兩地區(qū)乙肝防控提供一定的科學(xué)依據(jù)。 本研究共分為兩部分： 第一

2、部分：河南省漯河地區(qū)自然人群乙型肝炎病毒基因型的分子流行病學(xué)初步分析 目的：了解河南省漯河地區(qū)自然人群HBV基因型、血清亞型分布情況及基因型與血清亞型的關(guān)系；分析HBV基因型與臨床類型、HBeAg/抗-HBe血清學(xué)狀況之間的關(guān)系；分析HBV基因型與血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的關(guān)系；了解自然人群中HBV S基因的核苷酸水平變異及氨基酸水平變異情況。 方法：2005年以河南省漯河地區(qū)舞陽縣舞泉鎮(zhèn)、臨潁縣固廂鄉(xiāng)、召陵區(qū)萬金

3、為研究現(xiàn)場，以居民為研究對象，對居民進(jìn)行了一次橫斷面血清流行病學(xué)調(diào)查。2006年隨訪2005年HBsAg陽性者296人，采用固相放射免疫(SPRIA)法檢測HBsAg、抗-HBs、抗-HBc、HBeAg和抗-HBe五項(xiàng)乙肝病毒感染指標(biāo)，綜合ALT、B超和臨床體檢等結(jié)果，按照2005年12月10日制定的《慢性乙型肝炎防治指南》和衛(wèi)生部傳染病標(biāo)準(zhǔn)專業(yè)委員會2007年提出的《乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》(報(bào)批稿)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇可作出明確臨床診斷

4、的254例作為研究對象。其中無癥狀HBV攜帶者(ASC)144例，慢性乙型肝炎(CH)110例。男性136例，女性11 8例。平均年齡35歲。對從254例研究對象中抽取的血清標(biāo)本采用巢式PCR法擴(kuò)增HBV DNA。利用QIAamp DNA BloodMini Kit，按照試劑盒操作說明書要求從200μl血清中提取HBV DNA，以其作為模板，分別設(shè)計(jì)合成2對引物擴(kuò)增HBVS基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，直接將PCR產(chǎn)物送Ta

5、KaRa利用ABI PRISMTM 3730XL DNA Analyzer測序。利用DNASTAR軟件對測序標(biāo)本的核苷酸序列與從GenBank中獲取的HBV A-H各基因型標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對分析，繪制基因進(jìn)化樹，確定基因型。由核苷酸序列推導(dǎo)氨基酸序列，確定血清亞型。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS13.0進(jìn)行x2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher確切概率法，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：254例血

6、清標(biāo)本中，HBV S區(qū)陽性者219例，陽性率為86.22％。219例標(biāo)本的基因型分布為：B基因型22例，占10.05％;C型197例，占89.95％。血清亞型分布為：adr亞型192例，占87.67％；adw2亞型23例，占10.50％；ayr亞型3例，占1.37％；ayw1亞型1例，占0.46％。22例B基因型標(biāo)本的血清亞型為：adw2亞型21例(占95.45％)，ayw1亞型1例(占4.55％)：197例C基因型標(biāo)本的血清亞型為：a

7、dr亞型192例(占97.46％)，adw2亞型2例(占1.02％)，ayr 3例(占1.52％)。不同基因型的血清亞型構(gòu)成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0000)。 22例B基因型感染者中，15例(68.18％)為ASC，7例(31.82％)為CH；197例C基因型感染者中，109例(55.33％)為ASC，88例(44.67％)為CH。不同基因型的臨床類型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.2487)。 結(jié)論： 1河南

8、省漯河地區(qū)的HBV基因型分布以C基因型為主，存在少量的B基因型。 2.河南省漯河地區(qū)的HBV血清亞型分布以adr亞型為主，存在少量的adw2、ayr和aywl亞型。 3.HBV不同基因型的血清亞型的構(gòu)成不同。B基因型標(biāo)本的血清亞型主要為adw2，有極少量的aywl：C基因型標(biāo)本的血清亞型主要為adr，有少量的adw2和ayr。提示HBV基因型與血清亞型存在一定的相關(guān)性。 4 大于30歲的B基因型感染者比C基因型感

9、染者更有可能較早的出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。 5 B基因型感染者與C基因型感染者的ALT水平?jīng)]有差別。 6 HBV S基因在許多位點(diǎn)有堿基替換現(xiàn)象，近2/3的位點(diǎn)堿基替換為錯義突變。自然人群中存在一定的HBV S基因突變，發(fā)現(xiàn)1例疫苗相關(guān)突變。核苷酸替換的平均頻數(shù)較低，提示S基因相當(dāng)保守。 第二部分：河南省漯河地區(qū)和黑龍江省肇東地區(qū)自然人群乙型肝炎病毒前C和C基因突變的分子流行病學(xué)初步分析 目的：了解河南

10、省漯河地區(qū)和黑龍江省肇東地區(qū)自然人群慢性HBV感染者HBV BCP區(qū)T1 762/A1764、前C區(qū)A1 896變異株的流行率；分析兩種變異株感染與HBV基因型、HBeAg/抗-HBe血清學(xué)狀態(tài)及疾病臨床類型間的關(guān)系；了解兩種變異株感染與ALT水平的關(guān)系。 方法：河南省漯河地區(qū)：以第一部分254份血清中HBV S區(qū)PCR陽性者219份為研究對象。其中無癥狀HBV攜帶者(ASC)124例，慢性乙型肝炎(CH)95例。平均年齡38歲

11、，男性121例，女性98例。黑龍江省肇東地區(qū)：2005年，以黑龍江省肇東地區(qū)雙勝村和先鋒村兩個農(nóng)村為研究現(xiàn)場，以全屯居民為研究對象，對全屯居民進(jìn)行了一次橫斷面血清流行病學(xué)調(diào)查，采用固相放射免疫(SPRIA)法檢測HBsAg、抗-HBs和抗-HBc三項(xiàng)乙肝病毒感染指標(biāo)，采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測HBeAg和抗-HBe兩項(xiàng)感染指標(biāo)。結(jié)合1986年這兩個現(xiàn)場的血清流行病學(xué)調(diào)查資料，綜合ALT、B超和臨床體檢等結(jié)果，按照2005年12月1

12、0日制定的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇可作出明確臨床診斷且HBV S區(qū)PCR陽性者97例作為研究對象。其中無癥狀HBV攜帶者(ASC)78例，慢性乙型肝炎(CH)12例。肝硬化(LC)3例，肝細(xì)胞肝癌(HCC)1例，恢復(fù)3例。平均年齡34歲，男性52例，女性45例。對從河南省漯河地區(qū)219例研究對象和黑龍江省肇東地區(qū)97例研究對象中抽取的血清標(biāo)本采用巢式PCR法擴(kuò)增HBV DNA。利用QIAamp DNA Blood Min

13、i Kit，按照試劑盒操作說明書要求從200μl血清中提取HBV DNA，以其作為模板，分別設(shè)計(jì)合成2對引物擴(kuò)增HBV C基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，直接將PCR產(chǎn)物送TaKaRa 利用ABI PRISMTM 3730XL DNA Analyzer測序，采用熒光標(biāo)記雙脫氧終止法測定所擴(kuò)增的HBV C基因。在HBV C基因的測序結(jié)果中，利用DNASTAR軟件推導(dǎo)出BCP區(qū)1762位和1764位的核苷酸序列，以及前C區(qū)1896

14、位的核苷酸序列，與GenBank中的HBV參考株進(jìn)行比對進(jìn)而確定所獲得的測序樣本中發(fā)生BCP區(qū)和前C區(qū)突變的標(biāo)本。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS13.0進(jìn)行x2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher確切概率法，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 河南省漯河地區(qū)分別有40.22％和 52.51％慢性HBV感染者發(fā)生了HBVA1896和HBV T1762/A1764變異。黑龍江省肇東地區(qū)有28

15、.57％的慢性HBV感染者分別發(fā)生了HBVA1896和HBV T1762/A1764變異。 結(jié)論： 1.河南省漯河地區(qū)HBV BCP區(qū)T1762/A1764雙突變的檢出率明顯高于黑龍江省肇東地區(qū)。河南省漯河地區(qū)與黑龍江省肇東地區(qū)HBV A1896突變的檢出率沒有差別。 2.河南省漯河地區(qū)抗-HBe陽性HBV感染者發(fā)生BCP區(qū)T1762/A1764雙突變和前C區(qū)A1896突變的頻率高于HBeAg陽性HBV感染者。

16、 3.黑龍江省肇東地區(qū)抗-HBe陽性感染者發(fā)生前C區(qū)A1896突變的頻率高于HBeAg陽性感染者 4 河南省漯河地區(qū)HBeAg陽性HBV BCP區(qū)T1762/A1764雙突變感染者比野生型感染者有較高的ALT水平。 5 河南省漯河地區(qū)HBV前C區(qū)A1896突變感染者的ALT水平低于野生型感染者，抗-HBe陽性前C區(qū)A1896突變感染者的ALT水平低于野生型感染者，但HBeAg陽性前C區(qū)A1896突變感染者與野生型感

17、染者的ALT水平?jīng)]有區(qū)別。 6 河南省漯河地區(qū)和黑龍江省肇東地區(qū)C基因型感染者HBV BCP區(qū)T1762/A1764g)(突變的檢出率均高于B基因型感染者，C基因型感染者和B基因型感染者前C區(qū)A1896突變的檢出率沒有差別。 7 河南省漯河地區(qū)CH BCP區(qū)發(fā)生T1762/A1764雙突變的頻率高于ASC。ASC前C區(qū)發(fā)生A1896突變的頻率高于CH。 8 黑龍江省肇東地區(qū)ASC發(fā)生BCP區(qū)T1762/A1 76