丙型肝炎病毒體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立和超微結(jié)構(gòu)觀察及受體介導(dǎo)的入胞作用研究.pdf

1、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）所致的丙型肝炎易于慢性化，是引起慢性肝病的主要原因之一。目前全球約有1.7億HCV感染者。丙型肝炎與肝硬化、肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)，嚴(yán)重危害人類健康，已成為全球性的、重要的公共衛(wèi)生問題。迄今，HCV感染發(fā)病的機(jī)制尚不完全清楚，仍然缺乏有效的治療方法，疫苗的研究也遇到很大障礙。
　　HCV是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬。包膜病毒感染細(xì)胞的初始步驟

2、即是病毒外膜與靶細(xì)胞膜結(jié)合并相互作用的過程，目前初步認(rèn)為低密度脂蛋白受體（LDLR）、CD81、B族I型清道夫受體（SR-BI），claudin-1等多種宿主細(xì)胞膜分子參與其中，但由于一直以來都缺乏合適的研究模型，這些分子的角色認(rèn)定尚缺乏有力證據(jù)，其具體作用機(jī)制也不十分清楚。而深入研究論證HCV入胞相關(guān)的宿主因子，有助于加深對HCV感染發(fā)病機(jī)制的理解，為抗病毒治療尋找新的靶點。HCV進(jìn)入細(xì)胞后，通過復(fù)制，合成，裝配等過程最終釋放出成熟的

3、病毒顆粒。理論上完整的包膜病毒顆粒由核衣殼及外膜組成，但由于獲取HCV顆粒存在一定困難且不同來源的病毒顆粒在大小和形態(tài)上存在顯著差異，目前對HCV顆粒的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)尚無定論。因此，進(jìn)一步了解HCV顆粒在感染細(xì)胞中的形態(tài)和分布特征及感染細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)的病理改變，有利于更加直觀的認(rèn)識病毒的生命周期及其在復(fù)制成熟過程中與哪些宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在緊密聯(lián)系，為尋找更有效抑制病毒感染的新途徑提供依據(jù)。
　　2005年Rockefeller大學(xué)HCV

4、研究中心主任Charles M.Rice教授領(lǐng)導(dǎo)的實驗室建立了HCV細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，在一定程度解決了長期制約HCV研究的缺乏理想模型這一瓶頸問題。在Rice實驗室的幫助和指導(dǎo)下，我們構(gòu)建了丙型肝炎病毒體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（HCV cell-culture system,HCVcc）。以此系統(tǒng)為平臺，我們對HCV顆粒在感染細(xì)胞中的超微形態(tài)及感染細(xì)胞自身的病理改變進(jìn)行觀察研究，并進(jìn)一步論證了CD81和SR-BI兩種宿主表面分子在HCV感染中的重要

5、作用。
　　本實驗主要完成了以下三個方面的工作：
　　1、HCV細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立與鑒定
　　將Rice教授惠贈的含有全長HCV嵌合基因組的質(zhì)粒pFL-J6/JFH體外轉(zhuǎn)錄為HCVRNA，電穿孔轉(zhuǎn)染至Huh-7.5細(xì)胞，檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HCVmRNA及蛋白的表達(dá)，測定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒數(shù)量；收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育原始（naive）Huh-7.5細(xì)胞，測定并計算培養(yǎng)上清中HCV的感染性。實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)有HC

6、VmRNA及蛋白表達(dá)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有高水平的病毒拷貝數(shù)，感染性測定培養(yǎng)上清的TCID50/ml為6.98×104。結(jié)果表明成功建立了HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)并獲得有感染性的HCV。
　　2、HCVcc感染原始(naive)Huh7.5細(xì)胞的透射電鏡觀察
　　收獲轉(zhuǎn)染HCVRNA的細(xì)胞培養(yǎng)上清，與原始的Huh7.5細(xì)胞共孵育后制成超薄切片，透射電子顯微鏡觀察感染細(xì)胞內(nèi)HCV的形態(tài)結(jié)構(gòu)和分布特征，以及宿主本身結(jié)構(gòu)的變化。用專業(yè)

7、軟件測量觀察到的HCV顆粒直徑及病毒感染細(xì)胞前后的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔內(nèi)徑，應(yīng)用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。透射電子顯微鏡觀察到HCVcc感染后的Huh7.5細(xì)胞胞質(zhì)中含有大量的球形病毒樣顆粒，直徑在33-52nm之間，且多分布在核周的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近；感染細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)黃病毒科病毒感染后的特征性改變，如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增加，管腔擴(kuò)張，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)和含有大量HCV顆粒的包涵體等。形態(tài)學(xué)的研究不僅進(jìn)一步證明了HCV細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的可靠性，也更

8、加直觀的顯示了HCV顆粒在肝源細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)分布特征及其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的密切聯(lián)系。
　　3、siRNA干擾CD81及SR-BI的表達(dá)對HCVcc易感性的影響
　　使用化學(xué)合成的靶向CD81及SR-BI的siRNA序列分別轉(zhuǎn)染Huh-7.5細(xì)胞，抑制Huh7.5細(xì)胞表面分子CD81或SR-BI的表達(dá)，檢測轉(zhuǎn)染前后Huh-7.5細(xì)胞對HCVcc易感性的變化。結(jié)果顯示siRNA可有效的干擾CD81或SR-BI的表達(dá)，而CD81或SR-BI