人三葉因子2基因治療對實驗性大鼠胃潰瘍愈合的影響.pdf

1、研究背景 潰瘍病是臨床上的常見病、多發(fā)病，病程反復，復發(fā)率高。目前對于消化性潰瘍的治療，應用常規(guī)的抑酸，保護胃黏膜和抗幽門螺桿菌等治療后，仍有一部分病人消化性潰瘍不能治愈。其原因除了潰瘍本身、幽門螺桿菌感染、吸煙、心理因素等外，某些生長因子減少或者缺乏也成為潰瘍難以治愈的原因之一。三葉因子家族(trefoilfactorfamily，TFF)是一類對胃腸粘膜有保護作用的因子。TFF2是TFF中唯一的具有兩個三葉草型結構域(P-結

2、構域)和糖基化的小分子蛋白質，且集中分布在消化性潰瘍好發(fā)的胃竇和十二指腸。正常情況下，TFF2由胃體和胃竇的胃腺上皮黏液頸細胞合成與分泌，分泌量較少。在粘膜損傷后TFF2分泌增加，在消化性潰瘍中有特異性表達，提示其在維持胃腸道黏膜的完整性和促進快速修復過程中起重要作用。 目的和意義 本研究以乙酸性大鼠胃潰瘍模型為基礎，以為胃潰瘍尋求新的治療方法為目的，旨在解決以下幾個方面的問題：1、通過基因拼接方法得到人三葉肽2(hum

3、antrefoilfactorfamily2)hTFF2cDNA，構建真核表達hTFF2載體pcDNA3.1-TFF2，并驗證其生物學活性；2、單次局部應用pcDNA3.1(+)-hTFF2，觀測其對大鼠冰乙酸實驗性胃潰瘍的愈合是否有促進作用；3、從胃酸和胃黏液糖蛋白的分泌、胃粘膜上皮細胞增殖以及潰瘍底部微血管形成的角度探討hTFF2對促進胃潰瘍愈合的可能機制；4、對比西米替丁和hTFF2裸基因治療的療效；5、通過對hTFF2基因治療大

4、鼠實驗性慢性胃潰瘍的研究，為基因治療胃潰瘍應用于臨床提供基礎理論依據(jù)。 材料和方法 1.應用基因拼接方法合成hTFF2，構建該基因的真核表達載體，進行大量提純。2、實驗動物的分組：(1)在第二部分實驗中，將48只Wistar大鼠隨機分為治療組和對照組。應用冰乙酸法制作大鼠慢性胃潰瘍模型，治療組24只應用pcDNA3.1-hTFF2100μg/只，在造模時經(jīng)胃壁粘膜下注入，并每日肌肉注射生理鹽水100μl/只至標本采集。對

5、照組24只應用等容積pcDNA3.1100μg/只，在造模時經(jīng)胃壁粘膜下注入，并每日肌肉注射生理鹽水100μl至標本采集。術后第3日第7日第14日各處死治療組和對照組各8只大鼠。(2)在第三部分實驗中，將雄性Wistar大鼠64只隨機分為4組，每組16只，分別設pcDNA3.1-hTFF2治療組、西米替丁組和西米替丁與pcDNA3.1-hTFF2聯(lián)用組，及空質粒pcDNA3.1對照組。制模后分別在第7、14天每組各處死大鼠8只。

6、 結果 1.pcDNA3.1(+)-hTFF2基因治療對實驗性大鼠胃潰瘍愈合的影響對治療組和對照組第3日、7日、14日潰瘍面積進行分析，組間比較有顯著性差異(F=5.654P=0.032)，組間和組內有交互效應(p=0.000)，在制模術后第3日治療組和對照組的潰瘍面積分別為29.97±6.20mm2和30.20±6.25mm2(p=0.924)。兩者無顯著性差異。第7日治療組和對照組潰瘍面積分別為15.86±2.01mm2和1

7、7.11±2.48mm2(p=0.377)，兩者之間無顯著性差異。制模術后第14日，治療組和對照組的潰瘍面積分別是9.58±3.12mm2和17.03±2.23mm2，對照組潰瘍面積約是治療組的1.77倍(P=0.002)，表明TFF2可顯著促進胃潰瘍面積的縮小，加快潰瘍的愈合。但是其在制模后的第14日效果比較明顯，第7日潰瘍面積并無明顯縮小。 2.pcDNA3.1(+)-hTFF2對大鼠胃液總酸度的影響 對治療組和對照

8、組第3日、7日、14日胃總酸度進行分析，組間無顯著性差異(F=0.307P=0.588)。制模術后第3日治療組胃總酸度為14.24±3.07mmol/L，對照組為13.51±3.08mmol/L(P=0.734)，兩者間無顯著性差異。制模術后第7、14日，對照組和治療組胃總酸度之間相比均無顯著性差異(P=0.792P=0.765)，表明TFF2沒有抑制大鼠胃酸分泌的作用。 3.pcDNA3.1(+)-hTFF2對大鼠胃黏液糖蛋白

9、量的影響 對治療組和對照組第3日、7日、14日胃黏液糖蛋白量進行分析，組間有顯著性差異(F=100.007P=0.000)制模術后第3日黏液糖蛋白量治療組和對照組分別為2.54±0.25mg/g和2.41±0.27mg/g，兩者相比無顯著性差異(P=0.335)。制模術后第7日，治療組和對照組黏液糖蛋白量分別為4.77±0.32mg/g和2.97±0.29mg/g有顯著性差異(P=0.000)。制模術后第14日，治療組和對照組黏

10、液糖蛋白量分別為4.11±0.29mg/g和2.89±0.25mg/g，兩者相比有顯著性差異(P=0.000)，表明TFF2可顯著促進大鼠胃黏液糖蛋白的分泌。 4.pcDNA3.1(+)-hTFF2對胃潰瘍大鼠胃粘膜上皮細胞增殖的影響 正常大鼠胃粘膜內PCNA陽性細胞主要分布于胃小凹區(qū)域的腺管上皮，呈帶狀分布，形成細胞增殖帶。制模術后潰瘍旁胃粘膜內PCNA陽性細胞比正常大鼠增多，細胞增殖帶增寬。對治療組和對照組第3日、7

11、日、14日上皮細胞增殖指數(shù)進行定量分析顯示，組間有顯著性差異(F=31.422P=0.000)制模術后第3日，PCNALI治療組和對照組分別為16.45±2.38％和17.72±3.19％，兩者無顯著性差異(P=0.467)。 5.pcDNA3.1(+)-hTFF2對潰瘍底部新生血管的影響 采用兔抗人vWF多克隆抗體對潰瘍底部肉芽組織中的微血管進行免疫組化染色，微血管內皮細胞胞膜被染成棕黃色。對制模術后第7日和第14日潰

12、瘍底部肉芽組織中的微血管進行了定量分析，潰瘍底部微血管數(shù)量組間差異有顯著性(F=10.775P=0.005)。制模后第7日，治療組和對照組微血管數(shù)量分別為31.54±3.61個/視野和26.34±4.94個/視野，兩組相比有顯著性差異(P=0.028)。制模術后第14日，治療組和對照組微血管數(shù)量分別為39.36±3.69個/視野和29.93±4.15個/視野，兩者相比差異有顯著性(P=0.000)。 6.hTFF2蛋白在胃黏膜中

13、的表達 (1)免疫組織化學方法檢測hTFF2蛋白的表達 取制模后第3、7、14天大鼠胃組織，包括潰瘍底部和邊緣在內的3mm×5mm組織條，置于4％多聚甲醛溶液固定，SP法測定TFF2蛋白在胃黏膜中的表達，結果顯示TFF2蛋白定位于細胞漿，對照組未檢測到hTFF2蛋白表達，hTFF2治療組第3天、第7天、第14天均檢測到TFF2表達，以第7天表達最為明顯，第14天表達最少。 (2)Westernblotting方法

14、檢測hTFF2的表達 Western-blot分析檢測胃組織內hTFF2蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)治療組第7天胃組織內hTFF2表達最強，第3天較弱，第14天最弱，第7天和第14天及第3天相比差異均有顯著性(p=0.043＜0.05，p=0.006＜0.01)；而對照組第3天、第7天、第14天均無表達。這與免疫組化檢測的結果相符合。 7.pcDNA3.1(+)-hTFF2和西米替丁對潰瘍愈合影響的對照研究 對第7天及第14

15、天hTFF2治療組，空質粒pcDNA3.1對照組，西米替丁組和西米替丁與hTFF2聯(lián)用組胃潰瘍面積進行分析，組間有顯著性差異(F=14.29P=0.000)，hTFF2組和西米替丁組相比差異無顯著性(p=0.784)，hTFF2組和聯(lián)用組相比差異有顯著性(p=0.04)，hTFF2組和對照組相比差異有顯著性(p=0.000)，西米替丁和聯(lián)用組相比差異有顯著性(p=0.002)，西米替丁和對照組相比差異有顯著性(p=0.000)，聯(lián)用組和

16、對照組相比差異有顯著性(p=0.000)。 結論 1.應用基因拼接方法成功拼裝了hTFF2基因，并構建了hTFF2基因真核表達載體。 2.pcDNA3.1-hTFF2基因治療對大鼠胃潰瘍愈合有促進作用。 hTFF2基因治療對實驗性大鼠胃潰瘍愈合有促進作用，能顯著縮小潰瘍面積。增加胃黏液糖蛋白的分泌、促進胃粘膜上皮細胞增殖和潰瘍底部血管生成是其促進潰瘍愈合的機制之一。 3.pcDNA3.1-hTFF

17、2基因治療對潰瘍愈合的促進作用與胃酸分泌因素無關。 本研究證明hTFF2基因治療沒有減少大鼠的胃酸分泌，hTFF2保護胃粘膜作用不是通過抑制胃酸分泌或者抑制運動功能而起作用的。 4.pcDNA3.1-hTFF2基因治療對潰瘍愈合的促進作用與促進細胞增殖和增加潰瘍底部的微血管形成及促進黏液糖蛋白分泌有關。 乙酸性大鼠胃潰瘍愈合過程中，hTFF2促進胃潰瘍大鼠胃粘膜上皮細胞的增殖。潰瘍底部肉芽組織中的微血管數(shù)量顯著增

18、加，hTFF2可以通過促進潰瘍底部肉芽組織中微血管的形成，尤其是在潰瘍愈合的后期階段；從而促進乙酸性大鼠胃潰瘍的愈合。 5.pcDNA3.1-hTFF2裸質粒單次局部注射和每日應用西米替丁對大鼠胃潰瘍愈合同樣有效。 6.pcDNA3.1-hTFF2裸質粒單次局部注射合并每日應用西米替丁治療能增加其促進潰瘍愈合的作用。兩者聯(lián)用能抑制胃酸分泌，促進細胞增殖，增加黏液糖蛋白的量，加強兩者的促新生血管生成作用，最終加強其促潰瘍愈