銅鋅超氧化物歧化酶的核酸酶活性和DNA對(duì)其聚集的加速作用.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種發(fā)病機(jī)理未知的較常見(jiàn)成人神經(jīng)退行性疾病。銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)突變產(chǎn)生某種未知的獲得性新功能被認(rèn)為是導(dǎo)致ALS的原因之一，然而目前并不清楚SOD1在ALS發(fā)病過(guò)程中的作用。核酸作為貯存、傳遞遺傳信息的物質(zhì)，在生命活動(dòng)中發(fā)揮極為重要的作用，輕微的損傷也會(huì)影響生物體的正常功能。由于目前已發(fā)現(xiàn)DNA損傷涉及某些神經(jīng)退性行疾病，因此，本文從SOD1與DNA相互作用的角度，探討SOD1的獲得性新功能，取得如

2、下主要結(jié)果： 1. 利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜和SOD1內(nèi)源熒光猝滅的方法測(cè)定了SOD1對(duì)DNA的親和性，利用瓊脂糖凝膠電泳研究了SOD1和apoSOD1在二價(jià)金屬離子存在下將超螺旋質(zhì)粒DNA斷裂為缺口形式和線(xiàn)性形式，以及將線(xiàn)性DNA斷裂為小片段的性質(zhì)，結(jié)果表明在外源二價(jià)金屬離子存在下SOD1具有斷裂DNA的核酸酶活性。穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SOD1和apoSOD1斷裂DNA符合米氏動(dòng)力學(xué)規(guī)律。與其他蛋白質(zhì)和酶比較，發(fā)現(xiàn)SOD1這種

3、核酸酶活性具有相對(duì)特異性，并非所有蛋白質(zhì)都具有這種性質(zhì)。SOD1的這種核酸酶活性是其固有的性質(zhì)，與催化超氧陰離子歧化的活性中心無(wú)關(guān)。 2. 利用生物化學(xué)方法研究了外源二價(jià)金屬離子在SOD1核酸酶活性中所起的作用?；凇胺堑葍r(jià)多部位結(jié)合”模型，我們對(duì)金屬離子滴定SOD1-DNA復(fù)合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合，結(jié)果顯示復(fù)合物能夠提供至少兩個(gè)金屬結(jié)合部位：一個(gè)強(qiáng)結(jié)合部位和一個(gè)弱結(jié)合部位，表明SOD1可能通過(guò)“雙外源金屬離子”

4、的途徑斷裂DNA，即兩個(gè)金屬離子直接參與DNA斷裂過(guò)程。另外，對(duì)pH-SOD1斷裂DNA速率曲線(xiàn)進(jìn)行擬合的結(jié)果顯示催化過(guò)程中存在一個(gè)一般酸和一個(gè)一般堿。結(jié)合組氨酸特異性化學(xué)修飾結(jié)果，我們提出了SOD1在二價(jià)金屬離子存在下水解DNA的模型：即通過(guò)組氨酸、金屬結(jié)合水分子和雙金屬離子三者的協(xié)同作用水解DNA。 3. 將正常SOD1暴露于酸性環(huán)境模擬金屬結(jié)合區(qū)域SOD1突變體因突變導(dǎo)致的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低、聚集傾向增強(qiáng)的性質(zhì)，探討了DNA

5、加速SOD1聚集機(jī)理。利用直角光散射(RALS)、激光動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、原子力顯微鏡(AFM)、熒光顯微鏡系統(tǒng)研究了低pH下DNA加速SOD1聚集的性質(zhì)，結(jié)果表明在酸性條件下，DNA可以作為模板加速SOD1形成聚集體。由低pH和與DNA相互作用導(dǎo)致的SOD1疏水性增強(qiáng)和DNA的模板富集效應(yīng)是SOD1快速聚集的兩個(gè)決定性因素。 4. 利用透射電鏡(TEM)、AFM、熒光顯微鏡系統(tǒng)研究了酸性條件下DNA加速SOD1形成的聚集體形

6、態(tài)。在不同的DNA濃度下形成不同類(lèi)型的聚集體(聚集單體，寡聚體，大聚集體等)。SOD1與DNA的比例影響聚集體的緊密程度,比例較高時(shí)DNA形成緊密的聚集態(tài)，比例較低時(shí)則形成較為松散的聚集態(tài)。結(jié)合聚集動(dòng)力學(xué)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)DNA加速SOD1聚集的過(guò)程也是SOD1誘導(dǎo)DNA凝聚的過(guò)程，提出了SOD1與DNA相互作用導(dǎo)致SOD1聚集和DNA凝聚的反應(yīng)模型。 5. 利用酸性條件(pH4.0)對(duì)SOD1金屬結(jié)合性質(zhì)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，模擬

7、SOD1突變的效果，由RALS、DLS、熒光顯微鏡、AFM、TEM系統(tǒng)研究了ssDNA(24堿基)加速SOD1聚集的性質(zhì)。結(jié)果表明ssDNA可以作為SOD1聚集的模板，促進(jìn)納米和微米級(jí)ssDNA-SOD1聚集單體、寡聚體、微聚集體和大聚集體快速形成。因酸性環(huán)境和ssDNA相互作用導(dǎo)致的SOD1疏水性增強(qiáng)和蛋白質(zhì)局部濃度增大是SOD1快速聚集的決定性因素。ssDNA加速SOD1快速形成不溶性的大聚集體，有可能作為一種潛在的途徑避免SOD1

8、寡聚體累積產(chǎn)生的毒性，成為治療或預(yù)防包括ALS在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病的藥物。 6. 利用瓊脂糖凝膠電泳、RALS、DLS、TEM系統(tǒng)研究了近生理?xiàng)l件下DNA加速被氧化SOD1聚集的性質(zhì)。結(jié)果表明，當(dāng)SOD1與DNA共存于氧化環(huán)境中時(shí)，DNA顯著加速SOD1聚集。該結(jié)果為DNA在酸性到中性的條件下均加速SOD1聚集的假設(shè)提供了證據(jù)，即氧化導(dǎo)致SOD1疏水性增強(qiáng)和DNA的模板富集效應(yīng)是SOD1快速聚集的兩個(gè)決定性因素。我們推測(cè)所有SO