銅鋅超氧化物歧化酶的核酸酶活性和DNA對其聚集的加速作用.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種發(fā)病機理未知的較常見成人神經(jīng)退行性疾病。銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)突變產(chǎn)生某種未知的獲得性新功能被認為是導致ALS的原因之一，然而目前并不清楚SOD1在ALS發(fā)病過程中的作用。核酸作為貯存、傳遞遺傳信息的物質(zhì)，在生命活動中發(fā)揮極為重要的作用，輕微的損傷也會影響生物體的正常功能。由于目前已發(fā)現(xiàn)DNA損傷涉及某些神經(jīng)退性行疾病，因此，本文從SOD1與DNA相互作用的角度，探討SOD1的獲得性新功能，取得如

2、下主要結(jié)果： 1. 利用紫外-可見吸收光譜和SOD1內(nèi)源熒光猝滅的方法測定了SOD1對DNA的親和性，利用瓊脂糖凝膠電泳研究了SOD1和apoSOD1在二價金屬離子存在下將超螺旋質(zhì)粒DNA斷裂為缺口形式和線性形式，以及將線性DNA斷裂為小片段的性質(zhì)，結(jié)果表明在外源二價金屬離子存在下SOD1具有斷裂DNA的核酸酶活性。穩(wěn)態(tài)動力學實驗結(jié)果顯示SOD1和apoSOD1斷裂DNA符合米氏動力學規(guī)律。與其他蛋白質(zhì)和酶比較，發(fā)現(xiàn)SOD1這種

3、核酸酶活性具有相對特異性，并非所有蛋白質(zhì)都具有這種性質(zhì)。SOD1的這種核酸酶活性是其固有的性質(zhì)，與催化超氧陰離子歧化的活性中心無關(guān)。 2. 利用生物化學方法研究了外源二價金屬離子在SOD1核酸酶活性中所起的作用?；凇胺堑葍r多部位結(jié)合”模型，我們對金屬離子滴定SOD1-DNA復合物的紫外-可見吸收光譜數(shù)據(jù)進行了擬合，結(jié)果顯示復合物能夠提供至少兩個金屬結(jié)合部位：一個強結(jié)合部位和一個弱結(jié)合部位，表明SOD1可能通過“雙外源金屬離子”

4、的途徑斷裂DNA，即兩個金屬離子直接參與DNA斷裂過程。另外，對pH-SOD1斷裂DNA速率曲線進行擬合的結(jié)果顯示催化過程中存在一個一般酸和一個一般堿。結(jié)合組氨酸特異性化學修飾結(jié)果，我們提出了SOD1在二價金屬離子存在下水解DNA的模型：即通過組氨酸、金屬結(jié)合水分子和雙金屬離子三者的協(xié)同作用水解DNA。 3. 將正常SOD1暴露于酸性環(huán)境模擬金屬結(jié)合區(qū)域SOD1突變體因突變導致的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低、聚集傾向增強的性質(zhì)，探討了DNA

5、加速SOD1聚集機理。利用直角光散射(RALS)、激光動態(tài)光散射(DLS)、原子力顯微鏡(AFM)、熒光顯微鏡系統(tǒng)研究了低pH下DNA加速SOD1聚集的性質(zhì)，結(jié)果表明在酸性條件下，DNA可以作為模板加速SOD1形成聚集體。由低pH和與DNA相互作用導致的SOD1疏水性增強和DNA的模板富集效應是SOD1快速聚集的兩個決定性因素。 4. 利用透射電鏡(TEM)、AFM、熒光顯微鏡系統(tǒng)研究了酸性條件下DNA加速SOD1形成的聚集體形

6、態(tài)。在不同的DNA濃度下形成不同類型的聚集體(聚集單體，寡聚體，大聚集體等)。SOD1與DNA的比例影響聚集體的緊密程度,比例較高時DNA形成緊密的聚集態(tài)，比例較低時則形成較為松散的聚集態(tài)。結(jié)合聚集動力學等實驗結(jié)果，證實DNA加速SOD1聚集的過程也是SOD1誘導DNA凝聚的過程，提出了SOD1與DNA相互作用導致SOD1聚集和DNA凝聚的反應模型。 5. 利用酸性條件(pH4.0)對SOD1金屬結(jié)合性質(zhì)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，模擬

7、SOD1突變的效果，由RALS、DLS、熒光顯微鏡、AFM、TEM系統(tǒng)研究了ssDNA(24堿基)加速SOD1聚集的性質(zhì)。結(jié)果表明ssDNA可以作為SOD1聚集的模板，促進納米和微米級ssDNA-SOD1聚集單體、寡聚體、微聚集體和大聚集體快速形成。因酸性環(huán)境和ssDNA相互作用導致的SOD1疏水性增強和蛋白質(zhì)局部濃度增大是SOD1快速聚集的決定性因素。ssDNA加速SOD1快速形成不溶性的大聚集體，有可能作為一種潛在的途徑避免SOD1

8、寡聚體累積產(chǎn)生的毒性，成為治療或預防包括ALS在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病的藥物。 6. 利用瓊脂糖凝膠電泳、RALS、DLS、TEM系統(tǒng)研究了近生理條件下DNA加速被氧化SOD1聚集的性質(zhì)。結(jié)果表明，當SOD1與DNA共存于氧化環(huán)境中時，DNA顯著加速SOD1聚集。該結(jié)果為DNA在酸性到中性的條件下均加速SOD1聚集的假設(shè)提供了證據(jù)，即氧化導致SOD1疏水性增強和DNA的模板富集效應是SOD1快速聚集的兩個決定性因素。我們推測所有SO