鹽角草銅鋅超氧化物歧化酶基因(SeCZS)的克隆和耐鹽性分析.pdf

1、世界上土地資源正日益遭受著干旱、風(fēng)化、土壤鹽堿化等的多種脅迫。我國分布有廣泛的鹽堿地,面積約有0.33億hm2,還在逐步擴(kuò)大,鹽脅問題越來越嚴(yán)重。土壤中的鹽濃度高,對(duì)許多的植物造成了不可逆的傷害,抑制植物的生長,甚至造成植物死亡。世界各國在控制和改良鹽堿地方面,主要通過灌溉農(nóng)業(yè)、物理化學(xué)及生物技術(shù)等措施。目前,通過研究植物的耐鹽機(jī)制,利用生物技術(shù)方法克隆耐鹽植物的耐鹽基因,培育抗鹽作物品種,可以有效地解決土壤鹽堿化帶來的不利影響。鹽角草

2、是鹽角草屬一年生低矮草本植物,生于平原荒漠區(qū)湖邊潮濕鹽土上。它們是典型的耐鹽植物,耐鹽機(jī)制受到越來越多的研究者關(guān)注。超氧化物歧化酶(SOD)是機(jī)體內(nèi)可以催化超氧陰離子生成O2和H2O2的金屬酶,在生物體內(nèi)廣泛存在,而且可以迅速的清除活性氧。研究發(fā)現(xiàn),SOD在醫(yī)學(xué)、食品保健和化妝品方面都起到重要的作用,應(yīng)用廣泛。SOD可以起到防御損傷的作用,與多種疾病有關(guān),它們與植物的抗逆性方面也是密切相關(guān)的。
　　本實(shí)驗(yàn)選取的耐鹽植物為鹽角草,用

3、RACE的方法克隆出鹽角草Cu/Zn-SOD基因,使用生物學(xué)軟件分析核苷酸和氨基酸序列,并進(jìn)行同源性比對(duì)。構(gòu)建原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,使目的蛋白在重組菌中表達(dá),并分析了不同鹽濃度并含有抗生素的液體LB培養(yǎng)基中菌的生長情況,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),通過測(cè)定波長為600的OD值來分析Cu/Zn-SOD基因的耐鹽功能。為以后研究鹽角草Cu/Zn-SOD基因的應(yīng)用以及在植物抗逆性作用中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ),如培育耐鹽農(nóng)作物新品種。
　　1.通過簡(jiǎn)

4、并引物PCR擴(kuò)增和RACE技術(shù),克隆出鹽角草Cu/Zn-SOD基因。鹽角草Cu/Zn-SOD基因(GenBank登錄號(hào):JQ074238.2)全長為660bp,開放閱讀框長為459bp,推測(cè)編碼152個(gè)氨基酸,蛋白分子量約為15.1KDa,其氨基酸序列與堿蓬的序列相似性為96％,與黃燈籠辣椒的序列相似性為88%。生物學(xué)軟件分析表明Cu/Zn-SOD蛋白可能存在于細(xì)胞質(zhì)。
　　2.根據(jù)獲得的鹽角草Cu/Zn-SOD基因序列設(shè)計(jì)引物,

5、擴(kuò)增編碼區(qū),并在引物序列上分別加入NotI和BamHI酶切位點(diǎn)。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-Cu/Zn-SOD和對(duì)照pETDuet-1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21中。蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表達(dá)蛋白條帶大小與預(yù)期一致,說明目的蛋白成功表達(dá)。
　　3.將重組菌接種到含鹽濃度為1%、5%、6%、7%的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),10h后每3h,測(cè)定一次OD600值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)菌BL21(pET-Cu