缺鋅含銅超氧化物歧化酶水解DNA作用研究.pdf

1、銅鋅超氧化物歧化酶（Cu,ZnSOD）廣泛存在于微生物、植物、動(dòng)物的多種器官和組織中，主要功能是催化超氧陰離子歧化為過(guò)氧化氫和氧氣，維持生物體內(nèi)活性氧物種內(nèi)穩(wěn)態(tài)。 1993年，Rosen和Deng等報(bào)道了家族肌萎性脊髓側(cè)索硬化癥（fALS）與Cu,ZnSOD有密切關(guān)系，從而提出Cu,ZnSOD突變體可能是導(dǎo)致ALS的重要原因。目前為止，提出了異常氧化、Cu,ZnSOD突變體錯(cuò)誤折疊與聚集兩種模型來(lái)解釋Cu,ZnSOD導(dǎo)致ALS的

2、可能機(jī)理。但還沒(méi)有證據(jù)證明這兩種模型與ALS直接有關(guān)，因此我們推測(cè)可能還有其它導(dǎo)致ALS的途徑。 本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Cu,ZnSOD和其脫輔基形式（apoSOD）在某些二價(jià)金屬離子（Mg2+、Mn2+等）存在下具有類核酸酶性質(zhì)，能夠由水解途徑非特異性地?cái)嗔?DNA和質(zhì)粒pBR322 DNA。因此，我們提出銅鋅超氧化物歧化酶的突變引起結(jié)構(gòu)和金屬結(jié)合性質(zhì)的變化，以及由此導(dǎo)致的核酸酶性質(zhì)的變化可能也是導(dǎo)致ALS的重要原因。用缺鋅含銅超氧

3、化物歧化酶（CunSOD, n＝1～4）作為Cu,ZnSOD突變體的模型，研究了其在37 ℃、二價(jià)金屬離子（Mg2+，Mn2+）存在下斷裂DNA的化學(xué)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mg2+或Mn2+存在下CunSOD能夠以比Cu,ZnSOD和apoSOD更快的速率將λDNA水解斷裂成大小不同的片段，將質(zhì)粒pBR322 DNA斷裂成缺口和線性兩種形式，其活性受金屬離子濃度、pH等條件的影響。我們對(duì)這一過(guò)程進(jìn)行酶學(xué)研究發(fā)現(xiàn)低濃度金屬離子不能有效活化CunS

4、OD的核酸酶活性，而高濃度金屬離子會(huì)抑制這種活性，最適金屬離子濃度為：Mg2+為5 mmol/L，Mn2+為0.5 mmol/L。CunSOD水解斷裂pBR322的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)研究表明，反應(yīng)符合準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)及米氏動(dòng)力學(xué)：5 mmol/L Mg2+存在下CuSOD～Cu4SOD水解pBR322質(zhì)粒DNA的米氏常數(shù)Km（mol·L-1）值分別為2.87×10-5，4.0×10-5，4.06×10-5，4.91×10-5；Vmax(mol·L-1

5、·min-1)值分別為7.43×10-7，1.49×10-6，1.59×10-6，1.51×10-6；0.5 mmol/L Mn2+存在下CuSOD～Cu4SOD水解DNA的Km(mol·L-1)值分別為7.08×10-5，7.14×10-5，6.8×10-5，6.6×10-5；Vmax(mol·L-1·min-1)值分別為1.18×10-6，1.61×10-6，1.75×10-6，1.62×10-6。我們將CunSOD與單獨(dú)Cu2+，

6、Cu,ZnSOD，apoSOD進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)Cu2+不能有效水解斷裂DNA，CunSOD水解斷裂DNA的活性比Cu,ZnSOD和apoSOD大，但CunSOD（n＝1～4）的活性與Cu2+的個(gè)數(shù)不成正比，其活性順序?yàn)镃u,ZnSOD＜apoSOD＜CuSOD＜Cu2SOD≈Cu4SOD＜Cu3SOD。pH的影響也較明顯，CunSOD在pH4.6～8.0的寬范圍內(nèi)能有效斷裂DNA，最適pH為5.0。Cu2+滴定apoSOD的紫外-可見(jiàn)

7、吸收光譜結(jié)果表明，加入的Cu2+全部結(jié)合到apoSOD上，這也說(shuō)明CunSOD水解斷裂DNA的活性是SOD和Cu2+協(xié)同作用的結(jié)果。這一研究為理解Cu,ZnSOD與ALS的關(guān)系提供了一條新的思路。 Cu,ZnSOD，CunSOD（n＝1～4）的圓二色光譜顯示，Cu,ZnSOD和apoSOD的二級(jí)結(jié)構(gòu)差別較大，而CunSOD之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)相差不大，說(shuō)明CunSOD核酸酶活性的差異不完全是由其二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化引起，而可能是其局部空間結(jié)