聚唾液酸修飾銅鋅超氧化物歧化酶的研究.pdf

1、聚唾液酸(PSA)是唾液酸單體以α-2,8或/和α-2,9糖苷鍵連接起來的線性聚合物,具有強(qiáng)親水性、生物可降解性和很好的生物相容性。因其更有效的安全性,聚唾液酸被公認(rèn)為傳統(tǒng)藥物緩釋材料聚乙二醇(PEG)的理想替代材料。聚唾液酸修飾又稱為聚唾液酸化(polysialylation),即在蛋白質(zhì)或多肽類藥物表面通過化學(xué)交聯(lián)的形式共價連接聚唾液酸,以提高蛋白質(zhì)或多肽類藥物的穩(wěn)定性和藥理學(xué)效能。
　　 為了使聚唾液酸純度滿足藥用需求,本

2、論文在原有粗品聚唾液酸提純工藝的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步延伸了聚唾液酸的純化工藝。發(fā)酵液經(jīng)離心、乙醇沉淀、堿性沉淀和氯代十六烷基吡啶(CPC)絡(luò)合處理得到純度為90％左右的聚唾液酸粗品,粗品溶解后再經(jīng)超濾(100kDa)和DEAE F F離子交換層析和Scphacryl S-200 HR凝膠層析處理,得到高純度聚唾液酸樣品,累積回收率9.59％。該工藝得到的聚唾液酸蛋白質(zhì)含量為2.12×104mg/mg PSA,內(nèi)毒素去除率大于99.8％,經(jīng)HP

3、GFC分析,純度為99.71％,峰均相對分子量為16.2kDa,各種指標(biāo)均已達(dá)到醫(yī)藥級水平,可用于聚唾液酸化修飾藥用蛋白。
　　 本文選用銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)作為聚唾液酸修飾的靶向蛋白,初步測定其原始酶活為17.6×104NU/mg protein,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,呈電泳純,分子量為32kDa。
　　 分別以高純度聚唾液酸和CuZn-SOD為糖鏈供體和靶向蛋白,本文建立了一條完整高效的聚唾液

4、酸修飾CuZn-SOD的工藝。聚唾液酸經(jīng)活化后通過共價鍵連接到SOD表面的Lys上,再用TOSOH Toyopearl HW-55F凝膠過濾層析對聚唾液酸修飾的SOD進(jìn)行純化。以修飾酶交聯(lián)比和酶活保留率為優(yōu)化目標(biāo),通過L9(34)雙指標(biāo)正交優(yōu)化實(shí)驗,確定了PSA:SOD摩爾用量比40:1,反應(yīng)溫度25℃,反應(yīng)pH7.4為SOD聚唾液酸化的最適反應(yīng)條件。該工藝下制得的PSA-SOD的平均交聯(lián)比為3.86±0.17,平均酶活保留率為77.8

5、±1.6％。
　　 SDS-PAGE電泳分析聚唾液酸修飾前后SOD的分子量從32kDa增大為90～100kDa。用原子力顯微鏡觀察到修飾酶分子粒徑為10～15nm,約為修飾前的4倍。修飾酶表面有一層云狀包覆,呈單顆粒包覆和多顆粒包覆兩種顯微形態(tài),分別對應(yīng)單酶修飾和多酶修飾兩種修飾方式。TNBS法測得修飾酶氨基平均修飾率為24.4％,并通過蛋白殘基可及性分析,推測可能被修飾的位點(diǎn)為Lys(9,23,73,89,151)。進(jìn)一步的驗