熒光法研究外源性小分子對淋巴細胞鈣信號的影響.pdf

1、細胞內(nèi)游離鈣離子的濃度及其分布的變化代表著某種細胞功能的啟動、加強和抑制，是形成Ca2+信號的基礎(chǔ)。破譯不同型式的Ca2+信號所代表的生物學(xué)意義，可以大大加深人們對淋巴細胞功能調(diào)節(jié)機制的認(rèn)識，并進一步探索外源性刺激對免疫細胞鈣信號系統(tǒng)的擾動機理。
　　本文運用兩種測定胞內(nèi)游離鈣的熒光探針fura-2、fluo-3，以及測定細胞膜電壓的帶負電荷類菁熒光染料Bis-oxonol，應(yīng)用熒光光譜儀與激光共聚焦掃描顯微鏡分別在多細胞和單細胞

2、兩個層面研究了外源性化學(xué)小分子青霉素G、頭孢哌酮和丙烯酰胺對急性提取的人外周血淋巴細胞胞內(nèi)游離鈣離子信號的影響。選擇肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑(Thapsigargin)、非特異性鈣通道抑制劑La3+、Ni2+、電壓依賴L型鈣通道抑制劑尼卡地平(Nicardipine)、電壓依賴N型鈣通道抑制劑芋螺毒素(ω-conotoxin)和fura-2熒光猝滅劑Mn2+參與外源性小分子對胞內(nèi)游離鈣離子信號的干擾過程，分析了這些外源小分子引發(fā)淋巴細胞胞內(nèi)鈣水

3、平的升高和降低現(xiàn)象的作用機制。以熒光光譜學(xué)方法對抗生素的用藥安全問題、丙烯酰胺的食品安全問題給出基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時建立了丙烯酰胺SPE-HPLC-UV的檢測方法。
　　第一章闡述了細胞鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究動態(tài)，簡單介紹了淋巴細胞胞內(nèi)鈣離子水平的調(diào)控通路，綜述了細胞內(nèi)鈣離子濃度檢測方法的進展。
　　第二章β-內(nèi)酰胺抗生素中的青霉素G不僅臨床應(yīng)用廣泛，而且體外培養(yǎng)細胞的各種細胞生理液中均被加入100U/mL的青霉素G以抑制雜菌污染。

4、每公頃農(nóng)業(yè)用土壤中青霉素G殘留含量也超過一千克，這些青霉素G有可能進入食物鏈最終影響人體健康。應(yīng)用fura-2熒光探針測鈣技術(shù)研究了擬生理狀態(tài)下低劑量的青霉素G藥物小分子對淋巴細胞胞內(nèi)鈣信號的降低機制。青霉素G可以激活細胞膜上的鈣泵，誘導(dǎo)淋巴細胞胞內(nèi)游離鈣離子外排。細胞外的鈉、鈣離子濃度的改變協(xié)同影響淋巴細胞內(nèi)游離鈣的水平，低鈉和高鈣的胞外環(huán)境能夠加強青霉素G的排鈣作用。實驗證實了青霉素G能夠抑制鈉鈣交換蛋白的促進外鈣內(nèi)流的能力。青霉素

5、G能夠消弱強心劑藥物烏本苷提升胞內(nèi)鈣水平的藥效。
　　第三章第三代β-內(nèi)酰胺抗生素頭孢哌酮在擬生理狀態(tài)下與低劑量的青霉素G有著相同的排鈣趨勢，強度弱于青霉素G。頭孢哌酮也能夠抑制鈉鈣交換蛋白促進的外鈣內(nèi)流，同時低鈉和高鈣的胞外環(huán)境也能夠加強頭孢哌酮的排鈣作用。選擇肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑(Thapsigargin，Tg)和非特異性鈣通道抑制劑La3+、Ni2+參與頭孢哌酮的促進內(nèi)鈣外排或抑制外鈣內(nèi)流的降鈣過程中。研究發(fā)現(xiàn)頭孢哌酮有著和非特

6、異性鈣通道抑制劑Ni2+相似的針對該類鈣通道蛋白的作用位點。頭孢哌酮能夠抑制Tg激活的儲池操縱鈣通道(SOC)操縱的胞外鈣離子的內(nèi)流，競爭性結(jié)合SOC通道的鈣結(jié)合位點，而且頭孢哌酮對SOC操縱的胞外鈣離子的內(nèi)流的抑制作用是可逆轉(zhuǎn)的。
　　實驗證實了微量青霉素G和頭孢哌酮都能夠?qū)o息狀態(tài)免疫系統(tǒng)開始免疫應(yīng)答所要求的胞內(nèi)游離鈣水平升高產(chǎn)生抑制，發(fā)現(xiàn)血液中微量β-內(nèi)酰胺抗生素的存在能促進淋巴細胞胞內(nèi)鈣流失，導(dǎo)致淋巴細胞內(nèi)鈣水平降低，延遲

7、淋巴細胞對抗原的應(yīng)激反應(yīng)，擾動免疫系統(tǒng)平衡，從而降低淋巴細胞的免疫活力。
　　第四章近年來高溫烘烤煎炸淀粉類食物中所含相應(yīng)劑量的丙烯酰胺的毒性研究成為全球熱點。丙烯酰胺對多細胞的鈣離子信號的干擾試驗表明丙烯酰胺對胞內(nèi)鈣離子濃度變化的擾動表現(xiàn)為低濃度促進內(nèi)鈣增加，高濃度抑制內(nèi)鈣增加。雖然鈣超載與鈣缺乏相互對立，但均由同一刺激引起，只是表現(xiàn)在劑量上、時間上的不同。隨著丙烯酰胺的作用劑量加大，作用時間延長，淋巴細胞鈣離子的跨膜轉(zhuǎn)運被抑制

8、，細胞內(nèi)游離的總鈣量減少，該作用與細胞內(nèi)鈉離子和鉀離子協(xié)同相關(guān)，最終導(dǎo)致靜息鈣水平低于正常。單細胞層面重點論證了淀粉類食品中廣泛存在的低于54μg/mL以下的丙烯酰胺使淋巴細胞[Ca2+]i迅速升高的作用機制。低于54μg/mL以下的丙烯酰胺使細胞[Ca2+]i迅速升高并在400秒之內(nèi)形成較高水平鈣濃度平臺，若無其他干擾，升高的內(nèi)鈣可以在一小時之內(nèi)回復(fù)至初始狀態(tài)。胞外無鈣的外環(huán)境使丙烯酰胺無法誘發(fā)內(nèi)鈣升高。丙烯酰胺不能刺激胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫

9、和線粒體上的鈣池釋鈣，表明受體協(xié)調(diào)的鈣進入在此條件下沒有作為。1.0 mM Ni2+的加入將丙烯酰胺誘導(dǎo)的[Ca2+]i升高降低了35％，丙烯酰胺能夠誘導(dǎo)Mn2+進入淋巴細胞導(dǎo)致的fura-2熒光促滅，說明丙烯酰胺刺激了非選擇性離子通道的鈣進入。電壓依賴鈣通道(VGCC)L型抑制劑尼卡地平對丙烯酰胺的升鈣作用沒有作為，而電壓依賴N型鈣通道抑制劑芋螺毒素使內(nèi)鈣升高明顯降低30％，該結(jié)果表明，丙烯酰胺通過對非選擇性離子通道以及某些N型VGC

10、C的刺激，誘發(fā)內(nèi)鈣升高。丙烯酰胺對淋巴細胞的[Ca2+]i的干擾與細胞內(nèi)含量豐富的K+、Na+和Ca2+的協(xié)同作用相關(guān)聯(lián)。另一方面，實驗證實生理水平存在的維生素C、E能顯著降低丙烯酰胺導(dǎo)致的內(nèi)鈣升高，表明飲食中的抗氧化劑可以降低丙烯酰胺導(dǎo)致的細胞損傷。
　　第五章建立了丙烯酰胺SPE-HPLC-UV的檢測方法。樣品中丙烯酰胺的提取和純化選擇在低溫(0℃)高速離心(13000×g)的條件下。離心過程中通過硬化油脂層并伴隨微孔濾膜過濾

11、，簡單高效的降低了脂類雜質(zhì)的干擾。測試過程中選擇4.0％ v/v的乙腈水作為流動相，梯度洗脫程序既能改善色譜柱，又可以將丙烯酰胺從疏水雜質(zhì)中分離出來。工作曲線系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度限定在50-2000μg/L之間，檢測210 nm處吸收強度，校正曲線線性良好，線性系數(shù)R＞0.999。在100μg/kg濃度水平的加標(biāo)回收率為78％～107％。檢出限和定量限分別為6和23μg/kg。比LC-MS/MS方法的相應(yīng)數(shù)值稍高，但低于國家監(jiān)控食品中丙烯