一氧化碳中毒遲發(fā)性腦損害的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的: 一氧化碳（Carbon monoxide，CO）為無(wú)色、無(wú)臭、無(wú)刺激性的氣體，在水中的溶解度甚低，空氣混合爆炸極限為12．5％～74％。凡含碳的物質(zhì)燃燒不完全時(shí)，都可產(chǎn)生一氧化碳，因此一氧化碳的來(lái)源廣泛，如家庭用煤爐、燃?xì)鉄崴骱推?chē)發(fā)動(dòng)機(jī)廢氣為一氧化碳常見(jiàn)的來(lái)源。工業(yè)生產(chǎn)中接觸一氧化碳的作業(yè)則不下70余種，如冶金工業(yè)中煉焦、煉鐵、鍛冶、鑄造和熱處理的生產(chǎn)；化學(xué)工業(yè)中合成氨、丙酮、光氣、甲醇的生產(chǎn)；礦井放炮、煤礦瓦斯

2、爆炸事故等過(guò)程，或生產(chǎn)使用含一氧化碳的可燃?xì)怏w。炸藥或火藥爆炸后的氣體含一氧化碳約30％～60％。上述工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中都可能有接觸一氧化碳的機(jī)會(huì)，但職業(yè)性急性一氧化碳中毒多發(fā)生于一氧化碳泄漏同時(shí)通風(fēng)不良的情況下。由于一氧化碳無(wú)色無(wú)臭，泄露后不易及時(shí)發(fā)覺(jué)，急性一氧化碳中毒迄今是我國(guó)發(fā)病和死亡人數(shù)最多的急性職業(yè)中毒。一氧化碳也是許多國(guó)家包括我國(guó)北方在內(nèi)的意外生活性中毒中致死人數(shù)最多的毒物。 CO中毒可以造成以中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損害為主

3、的多臟器病變，其中CO中毒遲發(fā)性腦病是最常見(jiàn)且嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)病率約為0．2％-47．3％，在重度CO中毒患者中可達(dá)10％-40％。部分急性一氧化碳中毒的患者，在急性期昏迷蘇醒后癥狀完全恢復(fù)，經(jīng)歷2～30天的假愈期后再次出現(xiàn)記憶力障礙、遺忘癥候群、帕金森綜合征、舞蹈征、失語(yǔ)、失用、皮質(zhì)盲、癲癇發(fā)作、幻覺(jué)、精神異常等表現(xiàn)，臨床表現(xiàn)主要以癡呆為主，被稱為“一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病”。更多患者有輕微神經(jīng)精神缺陷包括人格異常和認(rèn)知障礙。輕度認(rèn)知障

4、礙的發(fā)生率可高達(dá)67％，縱使經(jīng)過(guò)高壓氧治療后也有18％的中毒者遺留有神經(jīng)精神癥狀。由于一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病病程較長(zhǎng)，治療困難，患者常遺留有認(rèn)知功能和記憶障礙等，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，并給社會(huì)帶來(lái)了巨大負(fù)擔(dān)，成為目前臨床醫(yī)學(xué)的重大難題。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多學(xué)者對(duì)遲發(fā)性腦病的機(jī)制進(jìn)行了研究，目前有很多假說(shuō)譬如免疫反應(yīng)或凋亡的存在可能參與了遲發(fā)型腦損害的發(fā)生，但遲發(fā)性腦病的確切的發(fā)病機(jī)制迄今尚未闡明。 研究方法: Wistar雄性

5、成年大鼠144只，應(yīng)用腹腔染毒的方法制造一氧化碳中毒模型，選擇染毒前和染毒后1天、3天、7天、14天和28天時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察。用99．9％的一氧化碳?xì)怏w進(jìn)行腹腔注射，共4次，每隔4小時(shí)一次，首次劑量為100ml/Kg，其余3次劑量減半為50ml/Kg。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察大鼠的臨床表現(xiàn)，并行大鼠被動(dòng)回避性跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，記錄跳臺(tái)潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)。生物化學(xué)方法測(cè)定血清和組織勻漿丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量、抗活性氧活力（anti-ROS）、

6、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽還原酶（GR）；免疫組織化學(xué)染色方法觀察大腦皮質(zhì)和海馬是否存在細(xì)胞凋亡或/和壞死的形態(tài)學(xué)變化；用Western Blotting方法分析大腦皮質(zhì)和海馬中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白以及線粒體蛋白細(xì)胞色素C、神經(jīng)絲蛋白（NF-H，NF-M，NF-L）含量的變化；末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的標(biāo)記脫氧脲核苷酸缺口末端標(biāo)記法，進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)；DNA裂解的檢測(cè)是

7、通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)組織提取的DNA是否存在DNA Ladder。 結(jié)果: 1．動(dòng)物模型的建立 腹腔染毒后5分鐘，動(dòng)物即出現(xiàn)明顯的中毒反應(yīng)，表現(xiàn)為拒食少動(dòng)，行動(dòng)遲緩，抽動(dòng)，煩躁不安，肢端皮膚和粘膜呈明顯的櫻桃紅色，部分大鼠出現(xiàn)角弓反張，震顫，繼而昏迷等癥狀，給予通風(fēng)，約7-8小時(shí)后大鼠完全蘇醒，觀察到第28天，大鼠的飲食和日?；顒?dòng)無(wú)明顯異常。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)測(cè)定中毒后大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的記憶力的變化（包括

8、跳臺(tái)潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)的記錄）。 2．跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與染毒前相比，染毒后大鼠記憶力明顯減退，表現(xiàn)為跳臺(tái)潛伏期縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增加，于染毒后第3天、7天、14天、28天最明顯（P<0．05）。 3．大鼠大腦皮質(zhì)、海馬和血清中氧化抗氧化系統(tǒng)的改變 3．1大腦皮質(zhì)：中毒后，MDA的含量呈現(xiàn)一個(gè)先升高后降低的趨勢(shì)。與染毒前相比，在染毒后第3天、7天、14天和28天分別升高了176％，140％，125％和113％?？够钚匝?/p>

9、活力在第7天、14天和28天時(shí)有明顯的下降；GSH-Px和GR在染毒后呈現(xiàn)一個(gè)緩和的下降趨勢(shì)； GSH在染毒后先升高而后漸下降138％，103％，69％，63％， and65％。 3．2海馬：MDA的含量呈現(xiàn)一個(gè)先升高后降低的趨勢(shì)。與染毒前相比，染毒后第1天、3天、7天、14天和28天MDA的含量分別升高了150％，136％，127％，121％和109％?；钚匝踉诘?8天時(shí)較染毒前降低19％（P<0．05）； GSH-Px和GR

10、在染毒后第3天時(shí)分別下降14％和22％；抗活性氧能力在第28天時(shí)較染毒前降低22％（P<0．05）； GSH的含量于第1天時(shí)先升高而后分別下降97％，75％，71％，and71％。 3．3血清：與染毒前相比，在染毒后第1天，3天，7天，14天和28天，血清MDA分別增加了162％，134％，125％，120％ and108％（P<0．05）?？够钚匝趸盍υ诘?8天時(shí)較染毒前降低10％（P<0．05）； GSH-Px和GR染毒后在

11、血清中呈逐漸下降的趨勢(shì)。GSH在血清中的變化趨勢(shì)與大腦皮質(zhì)和海馬相同。 4．免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)Bcl-2在染毒后第14天和28天時(shí)大鼠大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元胞漿和核周的表達(dá)明顯下降。 與對(duì)照組相比，Bax在大腦皮質(zhì)和海馬中的表達(dá)于染毒后第7天和第14天時(shí)明顯的升高，于第28天稍有下降。 Caspase-3在大腦皮質(zhì)和海馬中于第14天和第28天時(shí)在胞漿的表達(dá)比較明顯。 5．染

12、毒后大鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和線粒體蛋白Cyt-C、含量的改變。 5．1中毒大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白含量的時(shí)間變化趨勢(shì) 5．1．1 Bcl-2：大腦皮質(zhì)：與染毒前相比，大腦皮質(zhì)中Bcl-2的表達(dá)呈逐漸增加的趨勢(shì)，分別增加28％，37％，44％，75％，and77％（p<0．01）；在海馬中的表達(dá)而是逐漸下降的，22％，50％，59％，67％，and70％（p<0．01）。

13、5．1．2 Bax：在大腦皮質(zhì)中分別增加30％，49％，55％，61％，and62％；在海馬中32％，49％，47％，54％，and52％。 5．1．3 Caspase-3：在大腦皮質(zhì)中13％，64％，65％，90％，and89％；在海馬中6％，25％，27％，56％，and58％。 5．2中毒后大鼠腦組織中線粒體蛋白含量的時(shí)間變化趨勢(shì) Cyt-c：與對(duì)照組相比，大腦皮質(zhì)中染毒后第1天和第3天分別下降了16％，

14、43％，而后于第7天、14天和28天分別增加了42％，46％，133％。海馬中與對(duì)照組相比，與染毒后第1天、3天和7天分別下降了39％，47％，20％，而后于第14天和28天分別增加了4％和20％。 6．染毒后大鼠神經(jīng)組織NF蛋白含量的改變 7． TUNEL檢測(cè) 光鏡下可見(jiàn)DNaseⅠ降解處理后的陽(yáng)性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組，大腦皮質(zhì)和海馬中的細(xì)胞核呈圓形和不規(guī)則形，棕染，著色深，細(xì)胞界限不清，表明一氧化碳中毒后神經(jīng)元出現(xiàn)D

15、NA的斷裂，并伴有3'-OH形成。 8．核DNA的瓊脂糖凝膠電泳 中毒后大鼠大腦皮質(zhì)和海馬DNA沒(méi)有觀察到典型的180-200bp的DNALadder，梯狀條帶不明顯，這種陰性結(jié)果并不能排除有凋亡的存在，只表明DNA的損傷相對(duì)較輕，還不至于出現(xiàn)DNA Ladder。 結(jié)論: 1．一氧化碳中毒后有記憶障礙的發(fā)生，可能與遲發(fā)性腦組織損害有關(guān)。 2．一氧化碳中毒引起的氧化抗氧化系統(tǒng)的失衡在遲發(fā)性腦損害中