同軸靜電紡PLLA微陣列膜(MTAS)構(gòu)建復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的研究.pdf

1、目的:
　　探討同軸靜電紡技術(shù)制備的新型PLLA微陣列膜(microtube array sheet，MTAS)的神經(jīng)毒性及神經(jīng)組織相容性，檢測MTAS表面規(guī)則有序的溝槽結(jié)構(gòu)對于體外培養(yǎng)的雪旺細胞（Schwann cells，SCs）及神經(jīng)突起的導(dǎo)向性，并使用MTAS構(gòu)建復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管，從形態(tài)學、功能學、行為學評價其修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的效果。
　　方法:
　　根據(jù)ISO10993-5材料毒性國際標準檢測方法，制備PLLA-

2、MTAS材料的孵育液，并用其培養(yǎng)原代SCs，觀察細胞生長狀態(tài)，MTT法檢測細胞活力，AnnexinⅤ-PI雙標檢測細胞凋亡，之后采用Brd-U檢測細胞增殖，Transwell法觀察細胞遷移，Realtime-PCR檢測SCs重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、GDNF、NT4、BDNF、CNTF的表達，評價MTAS的神經(jīng)細胞毒性及神經(jīng)組織相容性;并將SCs和神經(jīng)元分別與MTAS共培養(yǎng)，激光共聚焦顯微鏡及電子掃描顯微鏡觀察SCs的形態(tài)、排布以及神經(jīng)

3、突起的延伸狀態(tài);將MTAS襯于中空神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)壁，構(gòu)建復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit+MTAS)，以中空神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit)作為對照，修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損，術(shù)后8w通過HE染色、免疫熒光、甲苯胺藍染色、電鏡、神經(jīng)電生理、足跡步態(tài)以及熱痛覺分析等方法，從形態(tài)到行為、功能，檢測復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)神經(jīng)缺損的效果;并在此導(dǎo)管基礎(chǔ)上，將原代SCs作為支持細胞種植于MTAS上，進一步構(gòu)建生物型復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit+MTAS+SCs)

4、，修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損，術(shù)后8w檢測生物型復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)神經(jīng)缺損的效果。
　　結(jié)果:
　　1.MTAS由多個直徑約為50μm的電紡纖維管有序的平行排列構(gòu)成，兩個相鄰的纖維管形成了規(guī)則的“V”形溝槽結(jié)構(gòu)，溝槽的平均深度為8μm，寬度為20μm。浸于37℃ PBS孵育28d后，材料表面的溝槽結(jié)構(gòu)依舊規(guī)則有序，且表面溝槽的寬度無明顯變化(p＞0.05)。使用MTAS預(yù)處理培養(yǎng)基培養(yǎng)原代SCs后，細胞形態(tài)、活力及凋亡情況均未發(fā)生明

5、顯變化(p＞0.05);SCs的增殖、遷移以及重要營養(yǎng)因子NGF、GDNF、NT4、BDNF、CNTF的表達等神經(jīng)再生過程中的關(guān)鍵生物學效應(yīng)亦未受抑制(p＞0.05)。MTAS材料穩(wěn)定性佳，對于神經(jīng)細胞無毒性作用，具有良好的神經(jīng)組織相容性。
　　2.SCs與MTAS共培養(yǎng)結(jié)果顯示，SCs種植于MTAS上之后，多個SCs細胞首尾相連，沿材料表面的“V”型溝槽有序的排列，其長軸與電紡纖維管長軸的排布一致。將背根神經(jīng)節(jié)(dorsal r

6、oot ganglion，DRG)感覺神經(jīng)元與脊髓前角運動神經(jīng)元細胞與MTAS共培養(yǎng)后，神經(jīng)突起也改變了其在普通培養(yǎng)皿上隨機生長的狀態(tài)，突起聚集成束，沿MTAS表面溝槽有序生長延伸。MTAS材料的表面形貌可以引導(dǎo)體外培養(yǎng)的SCs的有序排布以及神經(jīng)突起的定向延伸，具有良好的神經(jīng)源性細胞導(dǎo)向性。
　　3.將MTAS襯于SF/P(LLA-CL)中空神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)，構(gòu)建復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管（Conduit+MTAS），以中空神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit)

7、作為對照，修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損。結(jié)果顯示，兩種導(dǎo)管均可促進坐骨神經(jīng)再生。神經(jīng)導(dǎo)管移植8W后，免疫熒光檢測導(dǎo)管遠端的神經(jīng)再生情況，長入導(dǎo)管遠端的神經(jīng)纖維的面積及神經(jīng)纖維數(shù)量Conduit+MTAS組均大于Conduit組(p＜0.05);電鏡結(jié)果顯示:Conduit+MTAS組神經(jīng)導(dǎo)管中段再生有髓神經(jīng)纖維的直徑顯著大于Conduit組(p＜0.05)，且Conduit+MTAS組再生神經(jīng)纖維較規(guī)則，接近正圓，離心率為0.56±0.

8、02，與正常神經(jīng)（離心率為0.59±0.01）形態(tài)類似，而Conduit組的髓鞘神經(jīng)纖維形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則形及長條形，離心率達0.83±0.02，二者存在統(tǒng)計學差異(p＜0.05);高倍電鏡結(jié)果顯示再生神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)，觀察再生神經(jīng)突起的微管、微絲及周圍的膠原纖維:Conduit+MTAS組呈規(guī)則的點狀分布，而Conduit組則呈現(xiàn)點狀和短線狀交錯分布的狀態(tài);計算腓腸肌恢復(fù)率及單個肌細胞面積，結(jié)果顯示Conduit組肌肉萎縮狀況明顯較Cond

9、uit+MTAS組嚴重(p＜0.05);另外Conduit+MTAS組與Conduit組均有再生神經(jīng)纖維長入腓腸肌，且再生的神經(jīng)終末纖維與肌肉建立聯(lián)系，形成了運動終板，單位面積運動終板計數(shù)Conduit+MTAS組優(yōu)于Conduit組(p＜0.05);兩組足底皮膚也均有再生神經(jīng)纖維長入，有部分再生神經(jīng)纖維從皮膚基底層長入表皮，再生神經(jīng)的密度Conduit+MTAS組優(yōu)于Conduit組;神經(jīng)電生理結(jié)果顯示:Conduit+MTAS組的C

10、MAP峰值也顯著高于Conduit組的(p＜0.05);以熱痛閾值測量和坐骨神經(jīng)指數(shù)的行為學實驗分別檢測大鼠感覺及運動功能恢復(fù)狀況，結(jié)果顯示:兩組大鼠的感覺功能無顯著差異(p＞0.05);Conduit+MTAS組大鼠運動功能恢復(fù)優(yōu)于Conduit組(p＜0.05)。綜上結(jié)果顯示:MTAS材料具有良好的神經(jīng)細胞導(dǎo)向性，可以引導(dǎo)再生過程中神經(jīng)纖維的有序延伸，加快再生神經(jīng)對靶器官的再支配，促進神經(jīng)缺損損傷后的功能恢復(fù)。
　　4.以復(fù)合

11、神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit+MTAS)為基礎(chǔ)，在MTAS上種植支持細胞-原代SCs，構(gòu)建生物型復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管（Conduit+MTAS+SCs）。比較兩組再生有髓神經(jīng)纖維的密度、直徑、髓鞘厚度、G值，皮膚、肌肉神經(jīng)的再支配程度、腓腸肌濕重、單個肌細胞面積及CMAP峰值;并進行熱痛閾值和坐骨神經(jīng)指數(shù)的測量，結(jié)果顯示:除再生有髓神經(jīng)纖維的直徑及熱痛閾值二組無顯著性差異外，其余各測量指標Conduit+MTAS+SCs組均顯著優(yōu)于Conduit+

12、MTAS組(p＞0.05)。以復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit+MTAS)為基礎(chǔ)構(gòu)建的具有支持細胞-SCs的生物型復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit+MTAS+SCs)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損，可以進一步提高神經(jīng)再生的效率。
　　結(jié)論:
　　由多個PLLA電紡纖維管平行排布構(gòu)成的新型微陣列膜MTAS材料，具有規(guī)則的“V”型溝槽表面結(jié)構(gòu)。本研究體內(nèi)、體外實驗相結(jié)合，首次證明此材料穩(wěn)定性佳，無神經(jīng)毒性，具有良好的神經(jīng)組織相容性，其表面特殊的形貌修

13、飾可以促進體外培養(yǎng)的SCs有序排布及神經(jīng)突起的定向延伸，具有良好的神經(jīng)源性細胞導(dǎo)向性;以MTAS材料構(gòu)建復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管，修復(fù)周圍神經(jīng)缺損，有利于神經(jīng)再生及感覺、運動功能恢復(fù)，其效果顯著優(yōu)于中空神經(jīng)導(dǎo)管組;將SCs作為支持細胞，修飾MTAS構(gòu)建的復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管，可以進一步提高神經(jīng)再生的效率。本研究顯示:MTAS是一種有潛力的神經(jīng)組織工程材料，其特有的表面形貌為神經(jīng)組織工程的材料修飾提供了新的方法和思路，MTAS可以構(gòu)建復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管，修復(fù)周圍神