利用PFKFB3的生物節(jié)律性有效抑制舌癌進程的調控機制.pdf

1、1.研究背景與目的：
　　生物節(jié)律性對生物體的行為學和生理學的調控起著至關重要的作用，越來越多的證據(jù)已經證實，生物節(jié)律性紊亂可以提高致癌風險。輪班制工作，飛行時差反應，夜間光污染等均被列為引起生物節(jié)律性紊亂的因素。此外，生物節(jié)律性是否正常也可以作為一個獨立影響因子，對癌癥患者的預后具有預測性。基于上述依據(jù)，有學者提出時間療法這一概念。由于癌癥細胞與正常體細胞表現(xiàn)出不同的生物節(jié)律性，所以時間療法即是利用這種差異，而給癌癥患者安排藥物

2、或物理治療時間的方法。而這一療法在癌癥綜合治療及個性化治療中具有較好的應用前景已被眾多研究證實。然而，生物鐘紊亂對口腔相關疾病影響的研究尚較少。
　　近年來，PFKFB3及其產物iPFK2備受關注，因為其被證實為PFKFB家族中作用最強的激酶。iPFK2可以通過促進PFK1，這一糖酵解限速酶的功能，從而大大提高糖酵解反應的速率。而早在1927年，學者Otto Warburg即研究證實，即使在供氧充足的條件下，癌癥細胞生物代謝所需能

3、量的80％仍來源于無氧代謝——糖酵解過程，此經典供能模式被稱為“Warburg效應”。同時，大量臨床證據(jù)已證實，PFKFB3在眾多癌癥組織中都呈現(xiàn)出高表達。針對PFKFB3研發(fā)出的小分子抑制劑3PO已被作為單一靶向治療藥物正式進入臨床試驗階段?？梢?，PFKFB3在癌癥細胞能量代謝中扮演著極其重要的角色。
　　然而，目前為止，并無相關研究探究生物節(jié)律性的紊亂或者PFKFB3本身的生物節(jié)律性是否會影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展。如果能夠找出PF

4、KFB3的生物節(jié)律性與口腔癌癥之間的相互作用，并PFKFB3為藥物靶點，將時間療法應用于口腔癌癥的治療中，無疑是為口腔癌癥的綜合治療及個性化治療提供了一個全新的思路。
　　2.研究材料與方法：
　?。?）將購買獲得的人舌癌細胞系SCC9增殖培養(yǎng)后，采用血清饑餓處理的方法同步化，分6個時間點分別收集細胞，裂解后提取細胞的 RNA，采用RT-PCR的方法探索該細胞PFKFB3，CLOCK，Bmal1，Per1以及Per2的生物節(jié)

5、律性；
　?。?）采用基因測序的方法獲得PFKFB3啟動子全序列，并利用軟件定位出啟動子上所有 E-boxes的位置；利用質粒轉染和熒光素酶報告檢測技術證實CLOCK、Bmal1及其復合物對PFKFB3表達的調控機制，及在不同時間點下PFKFB3的表達差異；
　　（3）以SCC9為細胞模型，以3PO為PFKFB3的靶向抑制劑，利用RT-PCR、細胞流式等技術，體外證實不同時間點下，3PO抑制PFKFB3表達的能力是否有所差異

6、，以及時間療法對細胞生物行為的影響。
　　3.研究結果：
　?。?） PFKFB3基因在舌癌細胞中表達具有明顯的生物節(jié)律性，具有早晨表達被促進，夜間表達被抑制的規(guī)律。生物鐘核心正反饋基因CLOCK在舌癌細胞表達的生物節(jié)律性與PFKFB3基因極其相似；而生物鐘核心正反饋基因Bmal1表達紊亂，持續(xù)被抑制在極低水平；生物鐘核心負反饋基因 Per1及Per2在舌癌細胞中表達的生物節(jié)律性具有雙高峰；
　?。?） PFKFB3啟

7、動子上有33個E-box，其中包括一個嚴格的Bmal1/CLOCK復合體結合位點（CACGTGA），同時證實，CLOCK/Bmal1復合體對PFKFB3轉錄翻譯的調控規(guī)律為：增加CLOCK的表達，可顯著提高PFKFB3基因的轉錄水平；而這種作用會被Bmal1抑制；將CLOCK變異后，PFKFB3基因的表達幾乎接近正常細胞水平；因此PFKFB3基因的節(jié)律性表達中，CLOCK起的作用更為關鍵；
　?。?）體外不同時間點給予舌癌細胞PF

8、KFB3抑制劑3PO刺激，ZT7時癌細胞的增殖能力可被顯著抑制，凋亡能力可被顯著促進；而ZT19這一時間點下，藥物效果無顯著差異；同時，在兩個時間點下，PFKFB3抑制劑3PO對舌癌細胞的細胞周期均無明顯的影響。
　　4.研究結論：
　　本研究首次從細胞的基因水平證實，PFKFB3在舌癌細胞中不僅表達量增高，而且具有生物節(jié)律性，這一生物節(jié)律性極有可能受到 CLOCK/Bmal1復合體的直接調控，其中 CLOCK可能占有更為主