金霉素生物合成的分子調(diào)控機(jī)制.pdf

1、金霉素是Duggar于1948年從土壤微生物產(chǎn)金鏈霉菌（Streptomyces aureofacines）中分離得到，屬?gòu)V譜抗生素，是第一代天然四環(huán)素家族抗生素。它通過(guò)與細(xì)菌核糖體30S亞基的氨酰-tRNA特異性結(jié)合，阻止肽鏈的延伸，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮抗菌作用。至今在畜牧業(yè)有廣大的需求，作為農(nóng)用抗生素廣泛添加于動(dòng)物飼料中，每年可達(dá)十幾萬(wàn)噸。因此，開(kāi)展金霉素生物合成研究具有很大實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前，已經(jīng)從高產(chǎn)金霉素的產(chǎn)金鏈霉菌

2、工業(yè)菌株F3中克隆了金霉素的生物合成基因簇，結(jié)構(gòu)基因的相關(guān)研究揭示了金霉素是由II型聚酮合酶合成并經(jīng)多酶催化形成的生物合成途徑。生物信息分析發(fā)現(xiàn)，金霉素生物合成基因簇中有4個(gè)調(diào)控基因，其中ctcA、ctcB和ctcS分別與大器環(huán)素生物合成基因簇內(nèi)dacT3、dacT1和土霉素生物合成基因簇內(nèi)oxyTA1同源，然而它們?cè)诮鹈顾厣锖铣芍锌赡艿恼{(diào)控作用目前尚不清楚。
　　首先，研究了金霉素生物合成基因簇中屬于MarR家族的調(diào)控基因ct

3、cS，通過(guò)構(gòu)建ctcS基因缺失和回補(bǔ)突變株LJIA03和LJIA04，對(duì)比野生型發(fā)酵檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ctcS正調(diào)控四環(huán)素和金霉素的產(chǎn)生。對(duì)金霉素生物合成簇內(nèi)共轉(zhuǎn)錄單元進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大部分生物合成基因成首尾重疊分布在6個(gè)共轉(zhuǎn)錄單元上。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示突變株LJIA03對(duì)比野生型工業(yè)菌株，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄水平基本不變，而負(fù)責(zé)編碼外排蛋白的基因ctcR轉(zhuǎn)錄提高。EMSA實(shí)驗(yàn)確認(rèn)CtcS能夠作用于ctcR-ctcS的基因間隔區(qū)域，從而影響編碼

4、外排蛋白的基因ctcR。DNase I Footprinting實(shí)驗(yàn)定位了相互作用的兩個(gè)motif。蛋白純化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)CtcS重組蛋白為二聚體，因此，推測(cè)CtcS是以二聚體形式作用于兩個(gè)motif而起到調(diào)控作用。
　　隨后，研究了金霉素生物合成基因簇中屬于SARP家族調(diào)控基因ctcB。構(gòu)建了ctcB基因缺失菌株LJIA02，發(fā)酵檢測(cè)表明該突變株失去了四環(huán)素和金霉素的產(chǎn)生能力，熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示突變株LJIA02對(duì)比野生型

5、工業(yè)菌株，4個(gè)共轉(zhuǎn)錄單元和ctcQ的轉(zhuǎn)錄水平下降明顯。根據(jù)SARP蛋白家族結(jié)合DNA特征，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)CtcB結(jié)合區(qū)域，ctcG-D、ctcQ、ctcN-P和ctcT-W基因前具有保守的串聯(lián)重復(fù)序列，CtcB與之結(jié)合激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，這與ctcB基因缺失突變株中熒光定量RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。然而ctcH-K的-10區(qū)前也有類(lèi)似間隔特征的一段序列，可能正是該序列與保守序列之間的差異，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄下調(diào)水平不如具有保守序列的ctc

6、G-D、ctcQ、ctcN-P和ctcT-W基因明顯。ctcB在金霉素生物合成過(guò)程中必不可缺，對(duì)金霉素生物合成基因簇內(nèi)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起正調(diào)控作用。
　　最后，研究了金霉素生物合成基因簇中屬于LuxR家族調(diào)控基因ctcA。構(gòu)建了ctcA基因缺失菌株LJIA01，發(fā)酵檢測(cè)表明該突變株失去了四環(huán)素和金霉素的產(chǎn)生能力，熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示突變株LJIA01對(duì)比野生型工業(yè)菌株，金霉素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄水平大大降低。ctcA在金霉素生物

7、合成過(guò)程中必不可缺，對(duì)金霉素生物合成中的基因正調(diào)控機(jī)理有待進(jìn)一步研究。
　　總之，本研究在前期金霉素生物合成研究的基礎(chǔ)上，組合運(yùn)用體內(nèi)基因置換，生物信息分析，金霉素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄分析，以及EMSA和DNase I footprint檢測(cè)蛋白-DNA相互作用體外生化分析，確定了3個(gè)調(diào)控基因ctcS、ctcB和ctcA是作為正調(diào)控基因參與金霉素的生物合成。這些工作不僅增加對(duì)金霉素生物合成機(jī)制的理解，也為通過(guò)基因工程手段提高產(chǎn)金鏈霉