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文檔簡介
1、金霉素是Duggar于1948年從土壤微生物產金鏈霉菌(Streptomyces aureofacines)中分離得到,屬廣譜抗生素,是第一代天然四環(huán)素家族抗生素。它通過與細菌核糖體30S亞基的氨酰-tRNA特異性結合,阻止肽鏈的延伸,抑制細菌蛋白質的合成,從而發(fā)揮抗菌作用。至今在畜牧業(yè)有廣大的需求,作為農用抗生素廣泛添加于動物飼料中,每年可達十幾萬噸。因此,開展金霉素生物合成研究具有很大實際應用價值。目前,已經從高產金霉素的產金鏈霉菌
2、工業(yè)菌株F3中克隆了金霉素的生物合成基因簇,結構基因的相關研究揭示了金霉素是由II型聚酮合酶合成并經多酶催化形成的生物合成途徑。生物信息分析發(fā)現(xiàn),金霉素生物合成基因簇中有4個調控基因,其中ctcA、ctcB和ctcS分別與大器環(huán)素生物合成基因簇內dacT3、dacT1和土霉素生物合成基因簇內oxyTA1同源,然而它們在金霉素生物合成中可能的調控作用目前尚不清楚。
首先,研究了金霉素生物合成基因簇中屬于MarR家族的調控基因ct
3、cS,通過構建ctcS基因缺失和回補突變株LJIA03和LJIA04,對比野生型發(fā)酵檢測,發(fā)現(xiàn)ctcS正調控四環(huán)素和金霉素的產生。對金霉素生物合成簇內共轉錄單元進行分析,發(fā)現(xiàn)大部分生物合成基因成首尾重疊分布在6個共轉錄單元上。熒光定量RT-PCR結果顯示突變株LJIA03對比野生型工業(yè)菌株,結構基因轉錄水平基本不變,而負責編碼外排蛋白的基因ctcR轉錄提高。EMSA實驗確認CtcS能夠作用于ctcR-ctcS的基因間隔區(qū)域,從而影響編碼
4、外排蛋白的基因ctcR。DNase I Footprinting實驗定位了相互作用的兩個motif。蛋白純化過程中發(fā)現(xiàn)CtcS重組蛋白為二聚體,因此,推測CtcS是以二聚體形式作用于兩個motif而起到調控作用。
隨后,研究了金霉素生物合成基因簇中屬于SARP家族調控基因ctcB。構建了ctcB基因缺失菌株LJIA02,發(fā)酵檢測表明該突變株失去了四環(huán)素和金霉素的產生能力,熒光定量RT-PCR結果顯示突變株LJIA02對比野生型
5、工業(yè)菌株,4個共轉錄單元和ctcQ的轉錄水平下降明顯。根據SARP蛋白家族結合DNA特征,通過生物信息學預測CtcB結合區(qū)域,ctcG-D、ctcQ、ctcN-P和ctcT-W基因前具有保守的串聯(lián)重復序列,CtcB與之結合激活這些基因的轉錄,這與ctcB基因缺失突變株中熒光定量RT-PCR的實驗結果相吻合。然而ctcH-K的-10區(qū)前也有類似間隔特征的一段序列,可能正是該序列與保守序列之間的差異,導致轉錄下調水平不如具有保守序列的ctc
6、G-D、ctcQ、ctcN-P和ctcT-W基因明顯。ctcB在金霉素生物合成過程中必不可缺,對金霉素生物合成基因簇內結構基因轉錄起正調控作用。
最后,研究了金霉素生物合成基因簇中屬于LuxR家族調控基因ctcA。構建了ctcA基因缺失菌株LJIA01,發(fā)酵檢測表明該突變株失去了四環(huán)素和金霉素的產生能力,熒光定量RT-PCR結果顯示突變株LJIA01對比野生型工業(yè)菌株,金霉素生物合成基因的轉錄水平大大降低。ctcA在金霉素生物
7、合成過程中必不可缺,對金霉素生物合成中的基因正調控機理有待進一步研究。
總之,本研究在前期金霉素生物合成研究的基礎上,組合運用體內基因置換,生物信息分析,金霉素生物合成基因的轉錄分析,以及EMSA和DNase I footprint檢測蛋白-DNA相互作用體外生化分析,確定了3個調控基因ctcS、ctcB和ctcA是作為正調控基因參與金霉素的生物合成。這些工作不僅增加對金霉素生物合成機制的理解,也為通過基因工程手段提高產金鏈霉
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