PDE5抑制劑通過經(jīng)典Wnt信號降低骨量的研究.pdf

1、實(shí)驗?zāi)康?Wnt信號通路包括經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。研究表明，經(jīng)典Wnt信號不僅在骨發(fā)育與骨形成過程中發(fā)揮重要作用，對于骨量的維持也必不可少。磷酸二酯酶5抑制劑(Phosphodiesterase-5 inhibitor，PDE5i)目前在臨床上用于治療勃起功能障礙（Erectile dysfunction，ED）。已有文獻(xiàn)報道磷酸二酯酶5(Phosphodiesterase-5，PDE5)參與調(diào)控非經(jīng)典Wnt信號通路，但是PDE5抑制劑

2、對于Wnt信號所調(diào)控的成骨細(xì)胞分化及骨量的維持是否有影響尚未見報道。本課題通過研究PDE5抑制劑他達(dá)拉非對經(jīng)典Wnt信號的作用，探討PDE5抑制劑對骨量的影響。
　　實(shí)驗方法:HEK293細(xì)胞在L或Wnt3a條件性培養(yǎng)基刺激下，給予不同濃度的他達(dá)拉非（0，1，5，10μM）檢測淋巴增強(qiáng)因子1(Lymphoid enhancer factor-1，Lef1)熒光素酶報告基因的活性。PDE5抑制劑作用使cGMP胞內(nèi)水平上升并進(jìn)一步激活

3、PKG，通過使用不同濃度的PKG抑制劑KT5823（0，0.2，1，5μM）及轉(zhuǎn)染PKG不同亞型（PKG1和PKG2）siRNA，檢測Lef1熒光素酶報告基因的活性。經(jīng)典Wnt信號開放時引起β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的穩(wěn)定并進(jìn)入細(xì)胞核。分別用L或Wnt3a條件性培養(yǎng)基刺激HEK293細(xì)胞，并對細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)行分離，通過Western Blot檢測他達(dá)拉非(10μM)對于β-catenin蛋白水平及分布的影響。同時通過定量PCR檢

4、測他達(dá)拉非對β-catenin mRNA水平的影響。為了研究他達(dá)拉非對成骨細(xì)胞分化的影響，測定他達(dá)拉非作用下C3H10T1/2細(xì)胞堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)活性的變化，并通過定量PCR檢測成骨細(xì)胞標(biāo)志基因AP、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor2，Runx2）及Osterix(OSX)mRNA水平的變化。最后通過茜素紅染色研究他達(dá)拉非對細(xì)胞形成礦物

5、化結(jié)節(jié)能力的影響。
　　動物實(shí)驗方面，選用C57雌性小鼠，將小鼠隨機(jī)分為四組:對照組（給予生理鹽水）、他達(dá)拉非低(Tadalafil，3 mg/kg)、中(Tadalafil，15 mg/kg)、高(Tadalafil，45 mg/kg)劑量組。小鼠每天灌胃給藥一次，給藥8周。在給藥前、給藥4周及給藥結(jié)束時分別測定小鼠的股骨遠(yuǎn)端骨密度。隨后處死小鼠，取小鼠的一側(cè)股骨做組織切片，進(jìn)行HE染色。分離小鼠另一側(cè)股骨中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(

6、Bonemarrow derived mesenchymal stem cells，BMSC)進(jìn)行培養(yǎng)。通過定量PCR檢測成骨細(xì)胞的標(biāo)志基因AP、骨鈣蛋白(Osteocalcin，OC)及Wnt信號靶基因Dickkopf-1(Dkk1)和Lef1的mRNA水平。并通過茜素紅染色檢測BMSC形成礦物化結(jié)節(jié)的能力。
　　實(shí)驗結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)，給予他達(dá)拉非顯著降低Wnt3a誘導(dǎo)的Lef1熒光素酶報告基因的活性。給予他達(dá)拉非對β-caten

7、in mRNA水平?jīng)]有影響，但β-catenin的蛋白水平下調(diào)，且細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的蛋白水平都有所下降。使用PKG抑制劑KT5823增加Wnt3a誘導(dǎo)的Lef1熒光素酶活性，并且敲降PKG2顯著增加Wnt3a誘導(dǎo)的Lef1熒光素酶報告基因活性。在C3H10T1/2細(xì)胞中，給予他達(dá)拉非抑制Wnt3a誘導(dǎo)的成骨標(biāo)志基因AP、Runx2及OSX mRNA水平，細(xì)胞形成礦物化結(jié)節(jié)的能力降低。
　　動物實(shí)驗中，他達(dá)拉非給藥組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨密度

8、顯著降低，切片HE染色結(jié)果顯示股骨骨小梁數(shù)量體積明顯減少。與對照組相比，他達(dá)拉非給藥組分離出的BMSC中， AP與OC及Wnt通路靶基因Dkk1與Lef1的表達(dá)下降，形成礦物化結(jié)節(jié)的能力也顯著降低。
　　實(shí)驗結(jié)論:PDE5抑制劑下調(diào)β-catenin蛋白水平，降低Wnt信號通路靶基因Dkk1及Lef1的表達(dá)，負(fù)性調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路。PDE5抑制劑通過經(jīng)典Wnt信號通路調(diào)控成骨細(xì)胞分化，并具有減少骨量的作用。本研