機械牽伸通過Wnt5a、Wnt5b-JNK信號通路促進大鼠肌腱干細胞成骨分化.pdf

1、背景和目的:
　　肌腱病(Tendinopathy)是骨科常見疾病，常見的肌腱病有跟腱炎、網球肘、岡上肌腱炎等三十余種，職業(yè)運動員發(fā)生肌腱病往往意味著運動生涯的終結，目前對肌腱病尚無有效的治療方法。肌腱組織中出現異位骨化和脂肪組織是肌腱病的主要病理表現[1]，多數學者認為過度使用導致的肌腱損傷是肌腱病的主要致病原因，但其致病機制不詳。2007年Bi等[2]在肌腱組織中分離出了干細胞，稱為肌腱干細胞(Tendon stemcells

2、，TSCs)，TSCs是肌腱細胞的前體細胞，具有多向分化潛能。Gulotta等[3]證實TSCs具有間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和骨髓間充質干細胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)相似的生物學特性，TSCs對于肌腱細胞再生及肌腱損傷的修復起重要作用。體外研究發(fā)現，TSCs細胞形態(tài)的改變可以影響其分化方向，對TSCs施加4％強度的機械牽伸應力，TSC

3、s主要分化為肌腱細胞，參與肌腱細胞更新及肌腱組織修復，在8％強度的機械牽伸下，TSCs主要分化為非肌腱細胞（骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞）[4]，然而機械牽伸引起TSCs發(fā)生成骨分化的分子生物學機制尚不清楚。研究機械牽伸條件下TSCs向骨細胞分化的分子生物學機制，對于揭示肌腱病的發(fā)病機制具有重要意義。
　　我們研究大鼠肌腱來源干細胞(rat tendon-derived stem cells，rTDSCs)在機械牽伸應力誘導下的成骨

4、分化能力;檢測在機械牽伸應力誘導下非經典Wnt信號通路中的Wnt5a、Wnt5b基因及蛋白水平的表達;磷酸化JNK(Phosphorylated JNK，P-JNK)水平;以及Wnt5a，Wnt5b與JNK間的相互調控關系;研究機械牽伸應力是否通過Wnt5a/Wnt5b/JNK信號通路調控rTDSCs的成骨分化，探究肌腱組織異位骨化的形成機制。
　　方法:
　　第一部分:rTDSCs干細胞特性及多向分化能力的鑒定。自大鼠跟腱

5、組織中分離、培養(yǎng)細胞，用流式細胞術(Flow Cytometry，FCM)測定細胞的表面標記物:CD31抗體、CD44抗體、CD90抗體、CD34抗體，用免疫熒光法檢測核干細胞因子抗體(nucleostemin)、Nanog抗體、八聚體結合轉錄因子4抗體(octarner-binding transcriptionfactor4，Oct-4)。加入干細胞成骨誘導培養(yǎng)基做成骨誘導實驗，加入普通生長基(growthmedium，GM)作為對

6、照，成骨誘導21天后提取RNA，用實時定量聚合酶鏈式反應(real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)檢測成骨基因Runx2、DIX5 mRNA表達，并做茜素紅染色實驗;用干細胞成脂誘導培養(yǎng)基做成脂誘導實驗，而加入GM作為對照組，成脂誘導14天后提取RNA，RT-PCR檢測成脂基因PPARγ、ap2 mRNA表達，并做油紅染色實驗;用干細胞成軟骨誘導培養(yǎng)基做成軟骨誘導實驗，在誘導21天后將形成的

7、軟骨團塊切片做阿爾新藍染色。
　　第二部分:檢測rTDSCs經單軸機械牽伸(uniaxial mechanical tension，UMT)誘導后的成骨分化能力。rTDSCs在牽伸頻率為1HZ、牽伸強度為8％的條件下經UMT誘導48、60、72h，用RT-PCR檢測成骨基因Runx2，Dlx5，Alpl, Col1a1 mRNA相對于非牽伸對照組(non-loading control，NC)的表達，用免疫印跡法(western

8、blot，WB)測定Runx2蛋白相對于NC的表達，并做堿性磷酸酶染色實驗。
　　第三部分:rTDSCs經UMT誘導48、60、72h后檢測Wnt5a、Wnt5b、Ror2、Rac1mRNA相對于NC的表達。在UMT誘導48、60h后WB檢測Wnt5a、Wnt5b蛋白相對于NC的表達。
　　第四部分:研究Wnt5a及Wnt5b是否調控UMT誘導的Runx2蛋白表達。用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，ShRN

9、A）慢病毒分別干擾rTDSCs的Wnt5a及Wnt5b基因，然后rTDSCs經UMT誘導60h，WB檢測Runx2蛋白相對于慢病毒對照組的表達。
　　第五部分:分別用4％、8％強度的UMT誘導rTDSCs24h，用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色法檢測rTDSCs的細胞骨架改變。rTDSCs經UMT誘導48、60h后檢測P-JNK水平。UMT誘導前30min，在rTDSCs培養(yǎng)基中分別加入JNK興奮劑茴香霉素(anisomycin，AM)、J

10、NK抑制劑SP600125，UMT誘導60h后WB檢測Runx2蛋白相對于未加藥物干預組的表達。分別用互補脫氧核糖核酸(cDNA)過表達rTDSCs的JNK基因、shRNA干擾rTDSCs的JNK基因，然后施加UMT誘導，進一步證實JNK對UMT誘導的rTDSCs成骨分化具有調控作用。
　　第六部分:分別用shRNA干擾rTDSCs的Wnt5a、Wnt5b基因，施加UMT誘導后同時檢測P-JNK水平和Runx2蛋白表達，研究Wnt

11、5a、Wnt5b是否對JNK有調控作用;證實UMT通過Wnt5a/Wnt5b/JNK信號通路促進rTDSCs的成骨分化。
　　結果:
　　第一部分:在大鼠跟腱組織中分離、培養(yǎng)細胞，流式細胞分析表明細胞表面標記物CD90抗體陽性，免疫熒光檢測表明核干細胞因子抗體、Nanog抗體、Oct-4抗體陽性。加入成骨誘導培養(yǎng)基組的成骨基因Runx2、DIX5 mRNA表達較GM組明顯升高，成骨誘導后茜素紅染色陽性;加入成脂誘導培養(yǎng)基組的

12、成脂基因PPARγ、ap2 mRNA表達較GM組明顯升高，油紅染色陽性;細胞經成軟骨誘導21天后形成軟骨團塊，阿爾新藍染色陽性。
　　第二部分:rTDSCs經UMT誘導48、60、72h后成骨基因Runx2，Dlx5，Alpl, Col1a1mRNA表達較NC組高，Runx2蛋白水平也較NC組高。rTDSCs經UMT誘導72h后ALP染色陽性。
　　第三部分:rTDSCs經UMT誘導48、60、72h后Wnt5a、Wnt5b

13、、Ror2、Rac1 mRNA表達相對于NC升高，WB檢測Wnt5a、Wnt5b在UMT誘導48、60h的蛋白表達相對于NC組升高。
　　第四部分:用shRNA干擾Wnt5a、Wnt5b基因，經UMT誘導60h后提取蛋白做WB檢測，結果Runx2蛋白表達較慢病毒對照組下降。
　　第五部分:羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色顯示，rTDSCs經UMT誘導后細胞骨架發(fā)生不可逆改變，UMT可上調P-JNK水平（相對于NC組），JNK興奮劑AM及

14、抑制劑SP600125分別促進及抑制UMT誘導的Runx2 mRNA及蛋白表達。用cDNA及shRNA干擾JNK基因，分別促進及抑制UMT誘導的Runx2表達。
　　第六部分:shRNA干擾rTDSCs的Wnt5a、Wnt5b基因可抑制UMT誘導的Runx2蛋白及P-JNK表達，Wnt5a、Wnt5b shRNA對UMT誘導的Runx2抑制作用可通過JNK興奮劑AM解救。
　　結論:
　　第一部分:從大鼠跟腱分離、培養(yǎng)

15、的細胞采用FCM及免疫熒光檢測具有干細胞的特性，并且這種細胞具有向骨細胞、脂肪細胞軟骨細胞分化的能力。
　　第二部分:rTDSCs經UMT誘導后Runx2的mRNA及蛋白水平均較NC組升高，ALP染色陽性，UMT可以誘導rTDSCs成骨分化。
　　第三部分:rTDSCs經UMT后Wnt5a、Wnt5b高表達，表現為Wnt5a、Wnt5b的mRNA及蛋白表達較NC組升高。
　　第四部分:非經典Wnt信號通路中的Wnt5a