動物組織中微量糖鏈結(jié)構(gòu)分析方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、本論文以C57BL/6J小鼠肝臟、腎臟及心臟為研究對象,運用多種現(xiàn)代提取分離與分析技術(shù),建立了一種系統(tǒng)分析微量組織中神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside,GLs)、N-糖鏈及糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAGs)的分析方法,并將所建立的方法首次應(yīng)用于人宮頸癌細胞(HeLa)中N糖鏈和2型糖尿病小鼠(db/db)腎臟中GAGs組成及其精細結(jié)構(gòu)差異性研究。在此基礎(chǔ)上,以所得內(nèi)源性糖鏈和外源性海洋糖鏈為原料,利用糖生物芯片技術(shù)

2、,首次研究了GLS及海洋擬寡糖脂(NGLs)與甲型流感病毒(influenza A virus,H1N1)神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)的結(jié)合作用,探討和分析了內(nèi)源性GAGs和海洋酸性多糖與結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)的結(jié)合特性。
　　得出的主要結(jié)論如下:
　　(1).利用高效薄層色譜(HPTLC)和電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)聯(lián)用技術(shù),建立了一種

3、可適用于不同組織中微量GLS組成的快速分析方法。以C57BL/6J小鼠肝臟、腎臟和心臟組織為研究對象,首次對其組織中GLS進行比較分析。結(jié)果表明,不同組織來源的GLS的種類及組成存在較大差異。C57BL/6J小鼠肝臟中以GM1和GM2為主,心臟中主要含GM1、GM2和GT1a,而腎臟中5種GLS(GM3、GM2、GM1、GD1a和GT1a)含量差異不大。肝臟中GLS的種類和含量最多,與其作為脂類代謝的主要器官有關(guān)。
　　(2).以

4、C57BL/6J小鼠腎臟為研究對象,建立了一種從同一組織中分步釋放微量N-糖鏈和GAGs的分析方法。研究表明,C57BL/6J小鼠腎臟中主要是硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)。N-糖鏈輪廓分析表明,小鼠腎臟有60種復(fù)雜多樣的N-糖鏈,其中高甘露糖型所占比例較大,多數(shù)N-糖鏈含有乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)和巖藻糖(Fuc)。利用所建立的N-糖鏈分析方法,首次全面分析了HeLa細胞膜表面N-糖鏈的結(jié)構(gòu)。在獲得的34種N-

5、糖鏈中,除存在高甘露糖型N-糖鏈,二天線、三天線、四天線和五天線等復(fù)雜型N-糖鏈外,還發(fā)現(xiàn)了與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的平分型和Lewis糖鏈結(jié)構(gòu)。
　　(3).建立了一種適用于動物組織中微量GAGs精細結(jié)構(gòu)分析方法,并將其應(yīng)用于2型糖尿病小鼠腎臟組織中GAGs的精細結(jié)構(gòu)差異性分析。采用2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone,2-AMAC)熒光標(biāo)記柱前衍生高效液相色譜法,比較分析了C57BL/6J正常組小鼠,db/db糖尿病模型

6、組小鼠和海洋寡糖藥物HS203給藥組小鼠腎臟中GAGs的種類及二糖組成結(jié)構(gòu)差異性。首次發(fā)現(xiàn)db/db糖尿病組小鼠腎臟中HS較正常組N-硫酸化程度降低,而海洋寡糖藥物HS203可顯著提高病變組腎臟中HS硫酸化程度,表明HS203具有治療糖尿病腎病作用。
　　(4).利用寡糖芯片技術(shù),首次比較分析了6種內(nèi)源性GLS及36種海洋紅藻來源擬寡糖脂與甲型流感病毒NA的特異性結(jié)合作用。結(jié)果表明,36種海洋來源的不同類型的卡拉膠寡糖及瓊膠寡糖與

7、NA蛋白的結(jié)合強度絕大多數(shù)都強于內(nèi)源性GLS,且這種結(jié)合強度與寡糖硫酸根的有無、糖殘基種類、連接方式及聚合度大小等相關(guān)。值得提出的是,在42種寡糖中,脫硫λ-卡拉膠dsL7與NA結(jié)合力最強。
　　(5).利用多糖芯片技術(shù),首次探討了內(nèi)源性GAGs和海洋酸性多糖與2型糖尿病腎病相關(guān)因子CTGF的結(jié)合作用,并發(fā)現(xiàn)硫酸化程度和糖醛酸含量是影響CTGF與硫酸乙酰肝素類多糖識別的關(guān)鍵因素。
　　綜上,通過動物組織中GLS、N-糖鏈及G