殼聚糖作為組織工程材料的初步研究.pdf

1、組織工程研究主要包括四個方面：種子細胞；組織工程支架材料；構(gòu)建組織器官的方法和技術(shù)以及組織工程的臨床應(yīng)用。其核心是建立由細胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體，最大優(yōu)點是可形成具有生命力的活體組織，對病損組織進行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建并達到永久性替代。理想的組織工程支架材料通常應(yīng)具備以下特點：良好的表面相容性與生物相容性，適度的生物降解速率，良好的結(jié)構(gòu)相容性，具有一定的力學(xué)強度和可塑性。目前用作組織工程的生物材料主要有兩大類：1.人工合成高

2、分子材料：聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚乙烯醇、聚氨酯、聚酸酐；2.天然生物材料：殼聚糖、膠原、海藻酸鹽與天然珊瑚等。 殼聚糖作為自然界唯一存在的陽性多糖，作為組織工程支架材料具有細胞黏附性強，促進細胞分化增殖，良好生物相容性和可生物降解；高表面積/體積比，一定的機械強度和可塑性。因此我們用干熱交聯(lián)NaCl致孔與冰凍干燥法分別制備了兩種殼聚糖支架樣品，通過體內(nèi)外實驗對比分析兩種支架在孔隙率，吸水性能、機械力學(xué)性能、降

3、解率以及細胞組織相容性等方面的差異。相比冰凍干燥法，初步探討干熱交聯(lián)NaCl致孔作為新的簡便可行的方法在制備殼聚糖三維立體支架中的可行性和安全性，為進一步研究工作打下基礎(chǔ)。 材料和方法： 1.干熱交聯(lián)NaCl致孔制備殼聚糖支架 按一定質(zhì)量比充分混合經(jīng)100目網(wǎng)篩碾壓篩過NaCl與純化殼聚糖粉，壓制成片，厚度為2mm左右，12MPa/cm2，1min。將殼聚糖-NaCl片置于105℃真空干燥箱內(nèi)干熱交聯(lián)24h；置雙

4、蒸水中48h，溶出NaCL。浸好的殼聚糖支架真空干燥待用。 2.冰凍干燥制備殼聚糖支架 配制2wt％的殼聚糖2％乙酸水凝膠，過濾，4℃冰箱過夜去除氣泡。澆注成膜，75℃冰箱24h，冷凍成型，冰凍干燥過夜。75％的酒精固定交聯(lián)，雙蒸水浸泡。洗過的殼聚糖膠體重新凍干過夜。 3.細胞培養(yǎng)與細胞吸附率 實驗用支架(n=5)分為3組：CsN-1、CsN-2和凍干法。置于24孔培養(yǎng)板底，取0.8ml骨髓間充質(zhì)干細胞(

5、MSCs)懸液(5×104個/ml)放入孔中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中1h；吸附后，用1ml1MPBS輕輕的漂洗試樣；收集漂洗液體積=V，記數(shù)細胞濃度C，根據(jù)公式：吸附率=4×104-VC/4×104計算。 4.兩種殼聚糖支架的SD大鼠皮下植入實驗 SD大鼠12只，雌雄不限，體重155～205g，隨機分為2組，每組6只。將滅菌支架材料(凍干法或CsN-2)埋入大鼠背部皮下組織。術(shù)后大鼠單籠喂養(yǎng)，每天觀察并記錄全身基本情

6、況與切口區(qū)變化。定期處死大鼠(2只/組)，切取支架與周圍0.5cm～1cm組織，常規(guī)切片，HE染色，顯微鏡下觀察。 結(jié)果： 1.熱交聯(lián)NaCl致孔法構(gòu)建殼聚糖三維立體支架(CsN-1～4)：隨著NaCl/Chitosan質(zhì)量比越大，所構(gòu)建多孔支架的孔徑越大，孔隙率越高(18～82％)，吸水性能越強(14～91％)，降解速率越快(殘存質(zhì)量比為75.12～88.54％)，彈性模量則下降(12.89～8.30N/mm2)。

7、 2.凍干法制備殼聚糖支架：具有高孔隙率(98.83±0.24％)和強吸水性(96.36±0.37％)，降解快(殘存質(zhì)量比為58.21％)，彈性模量(1.99±0.13N/mm2)與正常生物組織最接近。 3.體外細胞培養(yǎng)實驗表明兩種方法制備的支架無細胞毒性，邊緣部位均可見MSCs黏附生長。可見有分布不均的MSCs延支架互通孔洞生長分布支架內(nèi)部，生長良好并分泌細胞外基質(zhì)填充支架間隙。 4.SD大鼠皮下埋植實驗表明兩種方

8、法制備的支架(CsN-2與凍干組)無組織毒性，刺激小，大鼠對兩種材料耐受性較好。HE染色組織切片顯示凍干法制備支架立體結(jié)構(gòu)易崩解，降解快，不能起到暫時錨定細胞與組織塑形作用；干熱交聯(lián)法制備支架立體結(jié)構(gòu)保持能力強，降解速度慢，與植入部位組織結(jié)合緊密，支架內(nèi)部可見大量的成纖維細胞和細胞外基質(zhì)分泌形成，膠原排列相對有序，可見新生血管。 結(jié)論： 1.本實驗創(chuàng)新采用熱交聯(lián)，鹽致孔的方法成功構(gòu)建殼聚糖三維立體支架，其中以CsN-2組

9、支架綜合性能最優(yōu)秀。 2.凍干法制備的殼聚糖支架具有高孔隙率和強吸水性，伸展性能與正常生物組織最接近。 3.體外細胞培養(yǎng)實驗表明兩種方法制備的支架無細胞毒性，干熱交聯(lián)法制備支架比凍干法更適合MSCs黏附生長增殖爬入。 4.SD大鼠皮下埋植實驗表明兩種方法制備的支架無組織毒性，刺激小。干熱交聯(lián)法制備支架立體結(jié)構(gòu)保持能力強，降解速度慢，起到良好的細胞引導(dǎo)與組織塑形作用。 5.綜合分析，干熱交聯(lián)法制備支架CsN