基于殼聚糖水凝膠的可注射性心肌組織工程研究.pdf

1、心肌梗死導(dǎo)致心肌細(xì)胞大量死亡,進(jìn)而可能發(fā)展為心力衰竭,具有很高的發(fā)病率與死亡率,嚴(yán)重威脅人類健康。針對(duì)心肌梗死的現(xiàn)有臨床治療手段,如藥物治療,介入治療,心臟移植等,均存在著一定局限性,不能完全滿足心肌梗死治療的需求。因此,尋找新的、更為有效的心肌梗死治療方法已成為臨床上急需解決的問(wèn)題之一。
　　近年來(lái),干細(xì)胞與組織工程的興起為心肌梗死的治療帶來(lái)了新的機(jī)遇。在早期研究中,研究者將單純的干細(xì)胞移植到缺血的心肌,發(fā)現(xiàn)心臟功能在一定程度上

2、得到改善。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)單純的干細(xì)胞移植往往存在著細(xì)胞滯留率低、存活率低等問(wèn)題,對(duì)心臟功能的長(zhǎng)期改善效果并不理想。研究表明,可注射性心肌組織工程策略有望克服上述問(wèn)題,近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注,研究進(jìn)展迅速。種子細(xì)胞、可注射性支架材料是可注射性心肌組織工程研究的重要組成要素。
　　在種子細(xì)胞研究方面,目前已有多種干細(xì)胞類型被用作心肌組織工程,包括多能性、定向能以及全能性的干細(xì)胞。然而,關(guān)于心肌組織工程理想的種子細(xì)胞類型研究

3、者尚未達(dá)成共識(shí)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)是心肌組織工程研究最為廣泛的多能性干細(xì)胞之一,具有潛在的臨床應(yīng)用前景。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),白色脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)與BMSC具有相似的性質(zhì),具有明顯的心梗修復(fù)效果,而其來(lái)源更為廣泛,細(xì)胞獲取更為簡(jiǎn)便,在心肌梗死的治療中具有重要研究?jī)r(jià)值。心臟干細(xì)胞(CSC)是心血管譜系定向能的干細(xì)胞,也是心肌組織工程研究的重要種子細(xì)胞。傳統(tǒng)的CSC來(lái)源主要是心肌組織,顯然這一來(lái)源在研究應(yīng)用中受到很大的限制。

4、近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),棕色脂肪組織CSC是心臟干細(xì)胞的新來(lái)源,具有與心臟來(lái)源CSC相似的較高心肌分化潛能,在未來(lái)心肌再生研究中具有潛在價(jià)值。然而,現(xiàn)有的棕色脂肪CSC分離方法效率較低,極大限制了當(dāng)前的研究,高效分離棕色脂肪CSC方法的建立對(duì)于推動(dòng)棕色脂肪CSC的研究與應(yīng)用具有重要意義。誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)是一類與ESC高度相似的新型干細(xì)胞,但卻避開(kāi)了ESCs面臨的倫理問(wèn)題。研究已表明,iPSC移植后具有促進(jìn)心梗修復(fù)的治療潛能。然而,

5、作為一種全能性的干細(xì)胞類型,致瘤性以及自身的免疫原性問(wèn)題,依然是iPSC在心肌組織工程應(yīng)用中備受關(guān)注的問(wèn)題,尚待進(jìn)一步闡明。
　　在干細(xì)胞治療研究中,一種可靠的細(xì)胞標(biāo)記方法對(duì)于細(xì)胞命運(yùn)追蹤與治療效果的評(píng)價(jià)至關(guān)重要?；诮M織學(xué)的檢測(cè)方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)同一只動(dòng)物的動(dòng)態(tài)追蹤,且檢測(cè)結(jié)果易受取材偏差的影響。基于熒光素酶(Fluc)標(biāo)記的生物發(fā)光成像技術(shù)是一種非侵襲性的檢測(cè)方法,能從整體水平上對(duì)活體動(dòng)物進(jìn)行連續(xù)追蹤,且具有定量、實(shí)時(shí)、靈敏的優(yōu)點(diǎn)

6、,已廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞與組織工程研究,對(duì)干細(xì)胞心梗移植后的命運(yùn)追蹤與治療效果評(píng)價(jià)具有重要價(jià)值。
　　在支架材料方面,也已有多種可注射性支架材料成功用于心肌組織工程研究,包括天然生物材料與人工合成生物材料。過(guò)去的研究中,基于可注射性支架材料心肌組織工程研究取得了一系列進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)可注射性支架材料在干細(xì)胞移植中可能具有提高細(xì)胞滯留與存活、調(diào)控干細(xì)胞功能發(fā)揮等多重作用。然而,以往的研究對(duì)可注射性支架材料發(fā)揮作用的機(jī)制關(guān)注甚少。我們以前的研究

7、中,成功將溫敏性殼聚糖水凝膠作為ESC移植的載體應(yīng)用于可注射性心肌組織工程,并證實(shí)了其促進(jìn)移植細(xì)胞滯留與存活、改善心梗微環(huán)境以及促進(jìn)心梗修復(fù)的效果。然而,殼聚糖水凝膠提高移植細(xì)胞存活、改善心梗微環(huán)境及促進(jìn)心梗修復(fù)效果的作用機(jī)制尚不清楚,且未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。
　　結(jié)合可注射性心肌組織工程當(dāng)前的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展以及存在的問(wèn)題,本論文主要從以下三個(gè)方面開(kāi)展相關(guān)研究工作:
　　第一部分:心肌組織工程不同種子細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、標(biāo)記及生物學(xué)

8、特性研究
　　實(shí)驗(yàn)一:不同干細(xì)胞分離、培養(yǎng)與分化研究。白色脂肪與棕色脂肪分別分離自大鼠腹股溝與肩胛骨處脂肪組織;通過(guò)膠原酶與胰酶消化法分離白色脂肪ADSC并進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、多向分化等對(duì)白色脂肪ADSC進(jìn)行鑒定;通過(guò)摸索膠原酶IV、DispaseII與胰酶的不同組合進(jìn)行棕色脂肪CSC分離的優(yōu)化,并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、成心肌分化對(duì)其進(jìn)行鑒定;利用Feeder培養(yǎng)體系對(duì)iPSC進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增,利用抗壞血酸(Vc)誘導(dǎo)iPSC向心

9、肌細(xì)胞分化,并對(duì)抗壞血酸的最佳作用濃度進(jìn)行摸索。
　　通過(guò)本部分實(shí)驗(yàn),建立白色脂肪ADSC、棕色脂肪CSC以及iPSC培養(yǎng)、分化等體系。結(jié)果表明:(1)0.1％膠原酶IV+0.1%DispaseII+0.05%胰酶消化能夠顯著提高棕色脂肪CSC的分離效率,從而建立一種基于“Cocktail”消化酶的高效分離棕色脂肪CSC的新方法;(2)抗壞血酸能夠顯著提高iPSC向心肌細(xì)胞的分化。
　　實(shí)驗(yàn)二:基于慢病毒顆粒的干細(xì)胞標(biāo)記研究

10、。通過(guò)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞構(gòu)建攜帶熒光素酶(Fluc)、單體紅色熒光蛋白(mRFP)與胸苷激酶(tTK)三報(bào)告基因的慢病毒顆粒;利用這一慢病毒顆粒,對(duì)ADSC、iPSC進(jìn)行感染標(biāo)記,并對(duì)不同干細(xì)胞感染的最佳復(fù)合感染指數(shù)(MOI)進(jìn)行摸索。
　　通過(guò)本部分實(shí)驗(yàn),建立了慢病毒顆粒制備體系,并掌握了利用慢病毒顆粒對(duì)不同干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記的關(guān)鍵技術(shù)。結(jié)果表明,以MOI為10-15慢病毒濃度感染ADSC效率可達(dá)70-80%;以MOI為15-2

11、0慢病毒濃度感染iPSC效率可達(dá)25-30%。
　　實(shí)驗(yàn)三:iPSC致瘤性與免疫原性研究。將未分化的iPSC、誘導(dǎo)分化但未純化的iPSC來(lái)源細(xì)胞(iPSC-derivates)及iPSC來(lái)源心肌細(xì)胞(iPSC-CMs)進(jìn)行裸鼠皮下移植,通過(guò)生物發(fā)光成像方法對(duì)移植細(xì)胞的存活、增殖及畸胎瘤形成規(guī)律進(jìn)行動(dòng)態(tài)追蹤;在免疫抑制與免疫活性的心梗小鼠模型中,分別進(jìn)行心肌內(nèi)移植iPSC與iPSC-CMs,通過(guò)生物發(fā)光成像方法對(duì)移植細(xì)胞的存活、增殖

12、及排斥的規(guī)律進(jìn)行動(dòng)態(tài)追蹤,并結(jié)合宿主淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的檢測(cè)對(duì)iPSC的免疫原性變化規(guī)律進(jìn)行揭示。
　　裸鼠皮下移植結(jié)果表明,iPSC分化狀態(tài)對(duì)其致腫瘤性具有顯著影響,未分化iPSC具有較高的致瘤性風(fēng)險(xiǎn);心梗環(huán)境下移植研究結(jié)果表明,iPSC在心梗環(huán)境下移植后,隨著在心肌內(nèi)的分化與發(fā)育,其免疫原性增強(qiáng),從而引起宿主免疫排斥反應(yīng)的增加。
　　第二部分:可注射性殼聚糖基水凝膠制備、生物學(xué)評(píng)價(jià)及細(xì)胞保護(hù)相關(guān)機(jī)制研究
　　實(shí)驗(yàn)一:溫敏

13、性殼聚糖基水凝膠的制備與生物學(xué)評(píng)價(jià)。首先制備了溫敏性的殼聚糖水凝膠,通過(guò)與ADSC共培養(yǎng)等對(duì)其細(xì)胞相容性進(jìn)行評(píng)價(jià);在心梗環(huán)境下注射后,通過(guò)組織學(xué)染色對(duì)其組織相容性、降解性與ROS清除作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果表明,殼聚糖基水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性與組織相容性;在心梗微環(huán)境下,殼聚糖基水凝膠具有適當(dāng)?shù)慕到馑俾?并能夠有效清除其中的ROS。
　　實(shí)驗(yàn)二:殼聚糖降解產(chǎn)物在模擬ROS環(huán)境下促進(jìn)ADSC黏附與存活的研究。在培養(yǎng)基中添加

14、H2O2模擬ROS環(huán)境,在這一模型下對(duì)ROS損傷ADSC的作用進(jìn)行了研究。在此基礎(chǔ)上,對(duì)殼聚糖降解產(chǎn)物D-Glu與N-AC-Glu清除ROS、保護(hù)ADSC的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　結(jié)果表明,ROS通過(guò)下調(diào)ADSC黏附相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)ADSC損傷;D-Glu、N-AC-Glu能夠通過(guò)ROS的清除,減少環(huán)境中ROS對(duì)ADSC黏附蛋白的下調(diào)作用,促進(jìn)ADSC黏附與存活,從而發(fā)揮對(duì)ADSC的保護(hù)作用。
　　第三部分:溫敏性殼聚糖

15、基水凝膠攜帶ADSC心梗移植的實(shí)驗(yàn)研究
　　心梗大鼠模型隨機(jī)分成4組,分別注射100μLPBS(PBS組)、100μL殼聚糖水凝膠(Chitosan組)、100μLADSC/PBS(ADSC/PBS組)、100μLADSC/Chitosan(ADSC/Chitosan組)。移植后不同時(shí)間點(diǎn),通過(guò)非侵襲性的生物發(fā)光成像方法,對(duì)ADSC的滯留與存活進(jìn)行動(dòng)態(tài)追蹤;通過(guò)組織學(xué)與分子生物學(xué)手段,對(duì)殼聚糖基水凝膠作用機(jī)制進(jìn)行揭示;移植后4w,

16、通過(guò)心臟組織學(xué)、超聲心動(dòng)圖、血流動(dòng)力學(xué)等多種手段,對(duì)心梗修復(fù)的效果進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果表明,殼聚糖基水凝膠作為ADSC心梗移植的支架材料,能夠顯著提高移植細(xì)胞在心梗部位的滯留與存活;在作用機(jī)制上,殼聚糖基水凝膠主要通過(guò)清除環(huán)境中的活性氧改善心梗微環(huán)境,促進(jìn)干細(xì)胞存活、歸巢與治療功能發(fā)揮,從而促進(jìn)心臟功能修復(fù)。
　　綜上所述,本研究建立了白色脂肪ADSC、棕色脂肪CSC及iPSC的培養(yǎng)、分化等平臺(tái)體系,改進(jìn)了棕色脂肪CS

17、C的分離方法;在此基礎(chǔ)上掌握了利用慢病毒標(biāo)記不同干細(xì)胞的關(guān)鍵技術(shù);基于這一標(biāo)記技術(shù)與非侵襲性成像平臺(tái),初步揭示了iPSC體內(nèi)移植后畸胎瘤形成與免疫原性規(guī)律;更重要的是,在體外與體內(nèi)兩種模型下證實(shí)了殼聚糖基水凝膠作為ADSC心梗移植的支架材料,能夠通過(guò)清除環(huán)境中的活性氧改善心梗微環(huán)境,促進(jìn)干細(xì)胞的存活、歸巢與治療功能發(fā)揮。本研究開(kāi)展的不同干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、標(biāo)記與生物學(xué)特性研究,揭示的殼聚糖基水凝膠改善心梗微環(huán)境與促進(jìn)心梗修復(fù)的作用機(jī)制,對(duì)