紅藻氨酸對(duì)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞作用—透射電鏡及原子力顯微鏡觀察.pdf

1、目的：離體培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)紅藻氨酸處理后，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，探討KA對(duì)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞是否也具有毒性損傷作用。 方法： 1.原代海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)出生48小時(shí)以內(nèi)的Wistar大鼠乳鼠，雌雄不拘，解剖鏡下快速完整分離出雙側(cè)海馬，切碎，0.25％胰蛋白酶消化20分鐘，移入種植液混懸，輕輕吹打數(shù)次，收集含單細(xì)胞懸液的上清液，活細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種1×107個(gè)細(xì)胞于75cm2的培養(yǎng)瓶中。置37℃、5％C02

2、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天半量換液一次。 2.星形膠質(zhì)細(xì)胞純化與鑒定待第8天細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁，將培養(yǎng)瓶置入37℃搖床中以250rpm振蕩14小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗一次，將貼壁的細(xì)胞用0.25％的胰酶消化下來(lái)后，按1×106個(gè)細(xì)胞接種致預(yù)先放有小蓋玻片的35mm的培養(yǎng)皿中，按1.5×106個(gè)細(xì)胞接種致25cm2小培養(yǎng)瓶中。每2～3天換液一次，待培養(yǎng)第7天用于實(shí)驗(yàn)。GFAP免疫化學(xué)染色鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞純度。 3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分

3、組紅藻氨酸作用濃度(A)有25μmol/L(A1)、250μmol/L(A2)兩個(gè)水平，作用時(shí)間(B)又分為10min(B1)及100min(B2)組，對(duì)照組以等量的生理鹽水取代KA，其余條件相同。 4.標(biāo)本制備 (1)透射電鏡標(biāo)本制備各組達(dá)到藥物作用時(shí)間后，棄去瓶中液體，PBS清洗三次，0.125％的胰酶消化，離心，棄上清，2％戊二醛固定，梯度酒精脫水，包埋染色后，透射電鏡觀察。 (2)原子力顯微鏡標(biāo)本制備與觀

4、測(cè)取出細(xì)胞飛片后，置入等滲PBS中漂洗3次，每次3min，2％戊二醛固定10min，三蒸水漂洗飛片3次，稍晾干，可放入原子力顯微鏡載物臺(tái)直接觀察。采用固態(tài)接觸模式，調(diào)試激光發(fā)射及接受狀態(tài)，使指示紅燈數(shù)目過(guò)半且穩(wěn)定。設(shè)置初始掃描參數(shù)：水平最大掃描范圍125μm、軸位范圍8μm、掃描速率為4Hz。推進(jìn)懸梁探針，自動(dòng)掃描，隨機(jī)找到細(xì)胞，逐級(jí)放大，圖像經(jīng)AFM自帶分析軟件三維重建后存儲(chǔ)。 結(jié)果： 1.純化換代以后的細(xì)胞經(jīng)GFAP

5、免疫組化染色后，陽(yáng)性率在90％以上。 2.透射電鏡觀察結(jié)果 生理鹽水對(duì)照組：細(xì)胞胞核較淡，形態(tài)規(guī)則，核仁不明顯，各細(xì)胞器形態(tài)正常；A1B1組：胞核尚規(guī)則，部分線粒體出現(xiàn)空泡樣變，可見(jiàn)少量溶酶體；A1B2組：部分胞核形態(tài)不規(guī)則，胞漿內(nèi)有較多空泡，溶酶體數(shù)目較多；A2B1組：胞核形態(tài)尚規(guī)則，異染色質(zhì)增多，部分胞漿內(nèi)有大量空泡，溶酶體增多；A2B2組：胞核形態(tài)扭曲、核仁明顯，胞漿內(nèi)有大量空泡，部分細(xì)胞可見(jiàn)自噬體。 3.

6、AFM觀測(cè)結(jié)果 (1)膜表面超微改變特點(diǎn) 生理鹽水對(duì)照組：細(xì)胞形態(tài)良好，突起自然，放大后膜表面光滑，未見(jiàn)異常結(jié)構(gòu)；A1B1組：細(xì)胞整體形態(tài)未見(jiàn)特殊異常，放大后可見(jiàn)膜表面較粗糙；A1B2組：細(xì)胞形態(tài)較腫脹，突起增粗，放大后膜表面粗糙；A2B1組：細(xì)胞腫脹，突起增多增粗，并有斷裂，放大見(jiàn)孔洞樣凹陷，分布不規(guī)則；A2B2組：細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，突起多有斷裂，放大后可見(jiàn)較多的孔洞樣凹陷，部分細(xì)胞甚至可見(jiàn)膜上有多條裂隙，呈“峽谷”樣結(jié)

7、構(gòu)。 (2)孔洞直徑大小及統(tǒng)計(jì)處理 對(duì)在A2B1和A2B2組所觀察到的孔洞樣結(jié)構(gòu)直徑進(jìn)行了測(cè)量，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，得P=0.002＜0.05，差異顯著。 (3)各組細(xì)胞大小近似測(cè)量 由于AFM自帶分析軟件不能直接測(cè)定細(xì)胞胞體體積，我們以三維重建后胞體的X、Y、Z軸的最長(zhǎng)徑值的積的1/2來(lái)間接反映細(xì)胞體積大小。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下： Descriptives體積┏━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━

8、┳━━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┓┃┃┃┃┃┃95％ConfidenceIntervalfor┃┃┃┃┃┃┃┃┃Mean┃┃┃┃┃┃┃┃┣━━━━━━━┳━━━━━━━┫┃┃┃┃N┃Mean┃Std.Deviation┃Std.Error┃LowerBound┃UpperBound┃Minimum┃Maximum┃┣━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━╋

9、━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━┫┃controlgroup┃21┃193.7794┃70.7818┃15.4458┃161.5599┃225.9988┃109.68┃318.84┃┃A1B1┃23┃214.1822┃90.4685┃18.8640┃175.0606┃253.3037┃106.95┃379.58┃┃A1B2┃19┃389.6383┃51.3815┃11.7877┃364.8732┃

10、414.4034┃308.62┃503.75┃┃A2B1┃18┃253.4641┃76.8727┃18.1191┃215.2362┃291.6920┃159.46┃446.33┃┃A2B2┃23┃414.4000┃51.5049┃10.7395┃392.1276┃436.6724┃337.60┃487.68┃┃Total┃104┃293.1946┃115.7822┃11.3534┃270.6778┃315.7114┃106.95┃503

11、.75┃┗━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┛對(duì)各組體積均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，以LSD法兩兩比較，其中A2B2、A1B2組分別與對(duì)照組、A1B1、A2B1組之間有顯著差異(P＜0.05)，其余各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： 1.KA毒性作用對(duì)培養(yǎng)的大鼠乳鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞造成損傷，濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，損傷程度越重。