桔小實(shí)蠅注射法RNAi效率提升方法的研究.pdf

1、雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi，RNA interference）技術(shù)通過dsRNA誘導(dǎo)序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默，已成為昆蟲基因功能研究的重要手段，在害蟲防治領(lǐng)域亦具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。一些研究表明，昆蟲通過胞吞作用吸收dsRNA，H2O2能提升細(xì)胞對 dsRNA的吸收；脂質(zhì)體保護(hù)dsRNA，克服與細(xì)胞膜之間的靜電斥力進(jìn)入細(xì)胞；殼聚糖與dsRNA形成的納米顆?？梢杂行ПＷo(hù)dsRNA，提升對dsRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。同時(shí)，高

2、溫、低溫、大腸桿菌等誘導(dǎo)可引起RNAi通路相關(guān)基因諸如Dicer-2、Ago-2和R2D2等的表達(dá)上調(diào)，從而激活RNAi。目前，對桔小實(shí)蠅進(jìn)行RNAi多采用注射法和飼喂法，而dsRNA介導(dǎo)的RNAi在雙翅目昆蟲普遍存在沉默效率不高、持效性差等問題。據(jù)此，本學(xué)位論文選取桔小實(shí)蠅3個(gè)不同類型的基因，包括組成性表達(dá)的肌動蛋白基因Actin-2、脂肪體和馬氏管特異性高表達(dá)的羧酸酯酶基因CarE-6以及在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)的神經(jīng)肽基因Natali

3、sin，對桔小實(shí)蠅注射添加不同介質(zhì)的dsRNA以及桔小實(shí)蠅經(jīng)高低溫或E.coli誘導(dǎo)處理后注射dsRNA，采用RT-qPCR技術(shù)檢測3個(gè)基因的RNAi效率，通過分析獲得提高不同類型基因RNAi效率的技術(shù)方案，為基于注射法的RNAi技術(shù)研究桔小實(shí)蠅基因的功能提供技術(shù)基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：
　　1、三種介質(zhì)對桔小實(shí)蠅RNAi效率的時(shí)間效應(yīng)
　　在1.5μg4000 ng/μL的dsRNA中分別添加H2O2（100 nL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5

4、％）、Lipofectamine RNAimax（dsRNA與其質(zhì)量體積比4:1）和Chitosan（質(zhì)量體積比濃度0.02%）后對桔小實(shí)蠅進(jìn)行混合注射，采用RT-qPCR技術(shù)檢測靶標(biāo)基因在注射后12 h、24 h、48 h和72 h的RNAi效率。結(jié)果表明，添加3種介質(zhì)后，不同基因在不同檢測時(shí)間點(diǎn)的RNAi效率存在差異。其中，添加H2O2后，Actin-2在72 h的RNAi效率得到提升，CarE-6在48 h的RNAi效率得到提升，

5、Natalisin在12h、24h和48h的RNAi效率得到提升，但與單獨(dú)注射dsRNA相比較差異不顯著。添加Lipofectamine RNAimax后，Actin-2在48 h的RNAi效率提升，CarE-6在48 h和72 h的RNAi效率得到提升，Natalisin在48 h的RNAi效率得到顯著提升，在72 h的RNAi效率得到提升。添加Chitosan后，Actin-2在48 h和72 h的RNAi效率得到提升，CarE-6

6、在72 h的RNAi效率得到提升，Natalisin在48 h的RNAi效率得到顯著提升，在72 h的 RNAi效率提升。說明添加H2O2、Lipofectamine RNAimax或殼聚糖可以提升桔小實(shí)蠅RNAi的效率。基于以上檢測結(jié)果，在后續(xù)條件優(yōu)化中，分別選取在注射dsActin72 h、dsCarE48 h和dsNatalisin24 h后進(jìn)行各基因RNAi效率的分析。
　　注射不同劑量的dsRNA（0.5μg、1μg和1

7、.5μg）后，3個(gè)基因的RNAi效率呈現(xiàn)dsRNA劑量依賴性，劑量越大，RNAi效率越高。
　　2、三種介質(zhì)對桔小實(shí)蠅RNAi效率的劑量效應(yīng)
　　在1.5μg4000 ng/μL的dsRNA中分別添加不同劑量的H2O2、Lipofectamine RNAimax和Chitosan后對桔小實(shí)蠅進(jìn)行混合注射，采用RT-qPCR技術(shù)檢測靶標(biāo)基因的RNAi效率。結(jié)果表明，對桔小實(shí)蠅注射dsRNA+H2O2（100 nL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%

8、），3個(gè)基因的RNAi效率均有所提升，但差異不顯著；注射dsRNA+H2O2（100 nL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%和15%）后，RNAi效率均有所下降。說明注射在H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)可以提升對靶標(biāo)基因的 RNAi效率，但不作為首選技術(shù)方案。對桔小實(shí)蠅注射dsRNA+Lipofectamine RNAimax（質(zhì)量體積比2:1）后，3個(gè)基因的RNAi效率均顯著提升，該方案可作為桔小實(shí)蠅基于注射法的RNAi優(yōu)選方案。對桔小實(shí)蠅注射dsRNA+C

9、hitosan后均能不同程度地提高對靶標(biāo)基因的RNAi效率。其中，dsActin添加Chitosan（質(zhì)量體積比濃度為0.08%）能夠顯著提升RNAi效率，添加3個(gè)濃度的殼聚糖均能顯著提升對靶標(biāo)基因CarE-6的 RNAi效率，當(dāng)dsNatalisin添加Chitosan（質(zhì)量體積比濃度為0.02%、0.04%）時(shí)，能顯著提升對靶標(biāo)基因Natalisin的RNAi效率?；赗NAi效率與成本考慮，對于組織特異性高表達(dá)的基因CarE-6和

10、Natalisin選擇添加質(zhì)量體積比濃度為0.02%的Chitosan，對于組成性表達(dá)的基因Actin-2選擇添加質(zhì)量體積比濃度為0.08%的Chitosan，以便獲得最佳的RNAi效果。
　　3、E.coli或高低溫處理對桔小實(shí)蠅RNAi效率的影響
　　對桔小實(shí)蠅注射不同體積的E. coli（OD600=1.0，100 nL、200 nL、400 nL）12 h后，注射1.5μg4000 ng/μL dsRNA，RT-qP

11、CR分析結(jié)果顯示，100 nL E.coli+dsActin、100 nL/200 nL E.coli+dsCarE以及200 nL E.coli+dsNatalisin處理后，對3個(gè)基因的RNAi效率無顯著提升。200 nL/400 nL E.coli+dsActin、400nL E.coli+dsCarE以及100 nL/400 nL E.coli+dsNatalisin處理后，RNAi效率均有所降低。因此， E.coli誘導(dǎo)桔小實(shí)

12、蠅不能有效提升對靶標(biāo)基因的RNAi效率。
　　分別將桔小實(shí)蠅置于低溫12℃和高溫42℃處理30 min后注射dsRNA，27℃條件下注射dsRNA為對照。RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照相比，高溫或低溫處理桔小實(shí)蠅會降低對靶標(biāo)基因的RNAi效率。因此，在室溫27℃條件下進(jìn)行基于注射法的RNAi，能夠獲得較好的RNAi效率。
　　綜上所述，針對不同類型的基因，為實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)基因的有效干擾，明確基因功能，推薦如下RNAi方案：

13、>　　（1）組成性表達(dá)的基因，27℃下，1.5μg4000 ng/μL的dsRNA，混合注射dsRNA+Lipofectamine RNAimax（質(zhì)量體積比2：1），或混合注射dsRNA+Chitosan（質(zhì)量體積比濃度0.08%），注射后48 h-72 h檢測表型。
　?。?）脂肪體和馬氏管特異性表達(dá)的基因，27℃下，1.5μg4000 ng/μL的dsRNA，混合注射dsRNA+Lipofectamine RNAimax（質(zhì)