桔小實(shí)蠅AChE的分離純化及生化毒理學(xué)特性研究.pdf

1、本學(xué)位論文以桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis為研究對象，采用局部點(diǎn)滴法測定了桔小實(shí)蠅不同地理種群對馬拉硫磷、高效氯氰菊酯和阿維菌素3種常用殺蟲劑的敏感性；在此基礎(chǔ)上，采用普魯卡因胺(Procainamide)親和層析法，成功分離純化了桔小實(shí)蠅不同地理種群和不同發(fā)育階段體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶(Acctylcholinestcrase，AChE)，并從昆蟲生理生化角度系統(tǒng)分析了桔小實(shí)蠅不同地理種群和不同發(fā)育階段AChE的生化毒理學(xué)

2、特性。研究工作得到了國家973計劃前期研究專項(xiàng)(2009CB125903)和重慶市杰出青年科學(xué)基金項(xiàng)目(CSTC2009BA1042)的資助，經(jīng)過2年多的研究，獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1桔小實(shí)蠅不同地理種群和不同發(fā)育階段AChE的純化
　　 采用普魯卡因胺親和層析法成功地從桔小實(shí)蠅不同地理種群和不同發(fā)育階段蟲體內(nèi)分離純化了AChE。各地理種群的純化倍數(shù)均達(dá)到500倍以上。其中，桔小實(shí)蠅東莞種群AChE的純化倍數(shù)最高(

3、561倍)，昆明種群次之(546倍)，廣州種群(510倍)和?？诜N群(509倍)的純化倍數(shù)相對最低；東莞、昆明、廣州和?？诜N群的AChE回收率分別為53.2％、43.9％、57.1％和57.3％。桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段AChE的純化指數(shù)亦不相同。其中，3齡幼蟲AChE的純化倍數(shù)最高(584倍)，蛹期次之(530倍)，成蟲最低(505倍)，3齡幼蟲、蛹和成蟲期AChE的回收率分別為56.3％、53.3％和48.5％。
　　 純化后的

4、酶液經(jīng)SDS-PAGE檢測，均顯示單一條帶，分子量均為58 KD，達(dá)到電泳純水平。
　　 2桔小實(shí)蠅不同地理種群和不同發(fā)育階段AChE生化毒理學(xué)特性研究
　　 2.1生物測定
　　 采用局部點(diǎn)滴法測定了桔小實(shí)蠅東莞、廣州、?？诤屠ッ?個地理種群對馬拉硫磷、阿維菌素和高效氯氰菊酯的敏感性。生物測定結(jié)果表明，桔小實(shí)蠅4個地理種群對馬拉硫磷的敏感性差異顯著，其中東莞種群對該藥劑相對最不敏感，其次依次為廣州、?？诤屠ッ鞣N

5、群；東莞、廣州和?？诜N群對阿維菌素的敏感性無顯著性差異，但與昆明種群間差異顯著；除廣州和?？诜N群對高效氯氰菊酯的敏感性無顯著性差異外，其它種群對高效氯氰菊酯的敏感性均有顯著性差異。3種藥劑間相比較，桔小實(shí)蠅對馬拉硫磷最不敏感，對阿維菌素相對最敏感。因此，推測在實(shí)際田間藥劑防治中，阿維菌素對桔小實(shí)蠅的防治效果可能會優(yōu)于馬拉硫磷和高效氯氰菊酯。
　　 2.2桔小實(shí)蠅不同地理種群AChE生化毒理學(xué)特性研究
　　 通過對純化后的

6、AChE酶促反應(yīng)的最適溫度和最適pH進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，桔小實(shí)蠅4個地理種群AChE均在pH7.4時活力達(dá)到峰值，4個地理種群理論最適pH分別為：東莞種群7.38、廣州種群7.39、?？诜N群7.44、昆明種群7.45；不同地理種群AChE在溫度為37℃時活力最高，理論最適溫度分別為：東莞種群36.0℃、廣州種群36.6℃、?？诜N群36.8℃、昆明種群36.3℃。
　　 比較桔小實(shí)蠅不同地理種群AChE的動力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，4個地理種群的米

7、氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)差異顯著。其中東莞種群Km相對最高，Vmax相對最低，說明東莞種群AChE對底物的親和力最弱，對底物的水解能力最差。離體抑制結(jié)果表明，6種抑制劑(毒扁豆堿、乙基對氧磷、殘殺威、BW284C51、涕滅威和毒死蜱)對桔小實(shí)蠅不同地理種群AChE均有良好的抑制效果。比較抑制中濃度I50和雙分子速率常數(shù)Ki發(fā)現(xiàn)，桔小實(shí)蠅各種群均對毒扁豆堿的抑制作用最敏感，而毒死蜱的抑制效果最差。東莞種群相對其它3個種群對

8、抑制劑的抑制作用最不敏感。
　　 2.3桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段AChE生化毒理學(xué)特性研究
　　 對純化后的AChE酶促反應(yīng)的最適溫度和最適pH進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段AChE在pH7.4時活力最高，其理論最適pH分別為：3齡幼蟲期為7.39、蛹期為7.35、成蟲期為7.45。各發(fā)育階段.AChE均約在37℃時活力最高，理論最適溫度分別為：3齡幼蟲期36.5℃、蛹期37.0℃、成蟲期36.8℃。
　　 比較

9、桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段AChE的動力學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，3個發(fā)育階段的米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率差異顯著。其中成蟲期Km相對最高，Vmax相對最低，說明桔小實(shí)蠅成蟲對底物的親和力最弱，水解能力最差；幼蟲期Km塒相對最低，Vmax相對最高，說明桔小實(shí)蠅幼蟲對底物的親和力最強(qiáng)，水解能力也最強(qiáng)。離體抑制結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種抑制劑(毒扁豆堿、乙基對氧磷、殘殺威、BW284C51、涕滅威和毒死蜱)對桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段AChE均具有良好的抑制效果。通過比較抑制中濃度