hnRNP-R-hnRNP-Q在視網(wǎng)膜感光反應(yīng)中的表達(dá)調(diào)控及功能研究.pdf

1、本論文的主要研究方向是研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)及相關(guān)功能。為此，我們首先采用cDNA微陣列技術(shù)對(duì)不同胎齡人的腦組織進(jìn)行了差異表達(dá)分析并篩選到了數(shù)個(gè)差異表達(dá)的基因。經(jīng)過進(jìn)一步的Northern blot分析，我們篩選出了細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅲ(COX-Ⅲ)和核內(nèi)不均一性核糖核蛋白R(shí)(hnRNP-R)這兩個(gè)在神經(jīng)發(fā)育過程中差異表達(dá)的基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示COX—Ⅲ的表達(dá)在神經(jīng)發(fā)育過程中顯著上調(diào)，而hnRNP-R的表達(dá)在神經(jīng)發(fā)育

2、過程中呈下調(diào)趨勢(shì)。由于本實(shí)驗(yàn)室的研究主要定位于前體mRNA加工過程，而最近有報(bào)道指出編碼RNA結(jié)合蛋白的hnRNP-R參與了神經(jīng)組織中的前體mRNA加工過程，所以我們選擇了hnRNP-R來進(jìn)行進(jìn)一步的研究。 為了研究hnRNP-R的表達(dá)和功能，我們利用匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)交聯(lián)的人工合成短肽制備了特異性的hnRNP-R抗血清。我們采用Western blot分析的方法檢測(cè)了hnRNP-R在多種細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示hnRNP-R

3、在這些細(xì)胞中普遍表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)分析(ICC)結(jié)果說明hnRNP-R的胞內(nèi)分布不隨RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞分化過程而改變。 早前的一些報(bào)道指出一些基因的可變剪接模式能夠調(diào)節(jié)它們的功能。所以我們利用計(jì)算機(jī)輔助分析預(yù)測(cè)了hnRNP-R的可變剪接模式。基于人類可變剪接數(shù)據(jù)庫(HASDB)的數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)了hnRNP-R的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有七種可變剪接方式。讀碼框分析發(fā)現(xiàn)其中兩種最可能編碼蛋白質(zhì)。我們通過RT-PCR分析和序列分析在胎兒腦組織

4、中檢測(cè)到了另外兩種亞型的存在。其中一種就是已報(bào)道的hnRNP-R，我們稱為hnRNP-R1。另一種與hnRNP-R1相比，缺少一個(gè)長(zhǎng)度為114bp的外顯子exon 5，其后續(xù)編碼氨基酸并未發(fā)生移碼。計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)分析顯示這段外顯子編碼的氨基酸序列中存在一個(gè)色氨酸磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)甲基化位點(diǎn)，這提示兩個(gè)亞型由于exon 5的差別可能具有功能差異。 由于蛋白質(zhì)的胞內(nèi)分布很可能影響其功能，我們檢測(cè)了R28細(xì)胞和Hela細(xì)胞中綠色熒光蛋白GF

5、P-hnRNP-R1和GFP-hnRNP-R2融合蛋白的胞內(nèi)分布。Western blot分析的結(jié)果顯示R28細(xì)胞中具有內(nèi)源性表達(dá)的兩個(gè)亞型，而HeLa 細(xì)胞中只監(jiān)測(cè)到hnRNP-R1。熒光檢測(cè)結(jié)果顯示GFP-hnRNP-R1和GFP—hnRNP-R2不論在神經(jīng)細(xì)胞(R28)還是非神經(jīng)細(xì)胞(Hela)中都具有類似的分布，兩種亞型蛋白都均勻地分布在細(xì)胞核內(nèi)。 接著，我們利用RT-PCR和Western blot分析的手段檢測(cè)了hn

6、RNP-R兩個(gè)亞型在人12周胎兒組織中的表達(dá)。RT-PCR結(jié)果都顯示hnRNP-R1的表達(dá)明顯高于hnRNP-R2，而且沒有組織特異性。而相反的，hnRNP-R2則在神經(jīng)組織中具有相對(duì)較高的表達(dá)。Western blot分析的結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。結(jié)果說明hnRNP-R2的表達(dá)是具有神經(jīng)組織特異性的，提示hnRNP-R2在神經(jīng)發(fā)育中具有重要功能。 為了說明hnRNP-R亞型在神經(jīng)發(fā)育過程中的表達(dá)，我們檢測(cè)了不同發(fā)育時(shí)期(1

7、2周和18周)胎兒神經(jīng)組織中的hnRNP-R兩種亞型蛋白質(zhì)表達(dá)量。半定量分析結(jié)果顯示hnRNP-R兩亞型相對(duì)β-actin的比例隨發(fā)育顯著下調(diào)。而hnRNP-R2相對(duì)hnRNP-R1的比例也同時(shí)下調(diào)。這說明hnRNP-R自身的可變剪接在神經(jīng)組織發(fā)育過程很可能具有重要的調(diào)節(jié)功能。 為了進(jìn)一步研究hnRNP-R在神經(jīng)組織中的功能，我們對(duì)其在大鼠不同神經(jīng)組織中的表達(dá)分布進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示hnRNP-R在大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)量很高，這

8、提示hnRNP-R在視網(wǎng)膜中具有重要的功能。通過對(duì)大鼠視網(wǎng)膜的免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)分析發(fā)現(xiàn)，hnRNP-R蛋白僅分布在視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)和內(nèi)核層(INL)的細(xì)胞中，在以光感受器細(xì)胞為主的外核層(ONL)中沒有表達(dá)。這提示hnRNP-R在這兩層細(xì)胞中可能具有特殊的功能。 更有趣的是，hnRNP-R在視網(wǎng)膜中的定位與c-fos的晝夜調(diào)節(jié)模式吻合。有過往研究表明hnRNP-R的一個(gè)80％

9、高度同源的蛋白質(zhì)hnRNP-Q參與了c-fos mILNA的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)過程，并且能與hnRNP-R結(jié)合。這提示hnRNP-R，hnRNP-Q和C-fso三者之間可能存在一定的聯(lián)系。c-fos在視網(wǎng)膜中的表達(dá)受到了晝夜周期的調(diào)控，而且其在GCL和INL的調(diào)控方式與其在ONL的調(diào)控方式完全不同。為此，我們建立了大鼠晝夜循環(huán)(LD12：12)模型并檢測(cè)了hnRNP-R在晝夜變化過程中的表達(dá)調(diào)控。 結(jié)果顯示hnRNP-R在視網(wǎng)膜GCL和

10、INL的表達(dá)隨著晝夜調(diào)控變化并不一致。相對(duì)INL層中hnRNP-R的表達(dá)，GCL層中hnRNP-R的表達(dá)在從光照期到黑暗期切換的過程中發(fā)生下調(diào)。這提示hnRNP-R的表達(dá)在GCL中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制與在INL中的不盡相同。為了研究hnRNP-R在視網(wǎng)膜中對(duì)c-fos表達(dá)的影響，我們需要選擇合適的細(xì)胞模型來進(jìn)行功能獲得性(Gain-of-function)分析。 我們選擇了一個(gè)永生化的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞R28細(xì)胞作為細(xì)胞模型。為了研究c-

11、fos的表達(dá)，我們建立起bFGF誘導(dǎo)的c-fos表達(dá)模型。在該模型的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了hnRNP-R的短暫轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。RT-PCR結(jié)果顯示hnRNP-R抑制了R28細(xì)胞中bFGF誘導(dǎo)的c-fos的表達(dá)。這與前面晝夜調(diào)節(jié)結(jié)果的推測(cè)符合。c-fos的mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)與其序列內(nèi)部的幾個(gè)順式元件有關(guān)，其中研究的最多的就是位于c-fos mRNA 3’非翻譯區(qū)(UTR)的AU富集元件(ARE)。早前報(bào)道顯示hnRNP-Q能夠增強(qiáng)插入有c-fos

12、3’-UTR ARE序列的RNA的穩(wěn)定性。 為了進(jìn)一步研究hnRNP-R和c-fos之間的作用機(jī)制，我們構(gòu)建了一個(gè)含有c-fos 3’-UTR的ARE序列的綠色熒光蛋白表達(dá)載體(GFP-ARE)。我們對(duì)hnRNP-R與GFP-ARE在R28細(xì)胞中的共轉(zhuǎn)染樣品進(jìn)行了Western blot分析。結(jié)果顯示hnRNP-R顯著地抑制了GFP-ARE的表達(dá)。這說明hnRNP-R能夠通過影響ARE-RNA的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)c—fos的表達(dá)。

13、 此外，考慮到hnRNP-Q和hnRNP-R的高度同源性以及已報(bào)道的hnRNP-Q對(duì)c-fos的調(diào)節(jié)作用，我們同時(shí)也檢測(cè)了hnRNP-Q在視網(wǎng)膜中的表達(dá)調(diào)控。 我們首先采用與hnRNP-R抗血清制備方法一樣的方法制備了hnRNP-Q的抗血清，并利用GST融合hnRNP-Q抗原肽段吸附純化了hnRNP-Q抗血清。我們通過RT-PCR和Western blot分析從兩個(gè)水平上分析了hnRNP-Q在大鼠視網(wǎng)膜的晝夜調(diào)控。

14、結(jié)果顯示hnRNP-Q的第8個(gè)外顯子的剪接隨著晝夜調(diào)節(jié)發(fā)生了明顯的調(diào)控，而這種變化與c-fos的晝夜調(diào)控變化完全一致。這提示hnRNP-Q不同亞型對(duì)c-fos mRNA穩(wěn)定性的影響不同。在hnRNP-Q已知的三個(gè)亞型中，hnRNP-Q2在第8個(gè)外顯子的剪接模式上與hnRNP-Q1/hnRNP-Q3不同。然而Western blot分析在蛋白質(zhì)水平上對(duì)hnRNP-Q1/Q2/Q3的檢測(cè)并未顯示明顯的晝夜調(diào)控，這提示可能存在其他潛在調(diào)控機(jī)制

15、。在對(duì)不同類型細(xì)胞的RT-PCR分析和Western blot分析的結(jié)果顯示hnRNP-Q的剪接模式在不同細(xì)胞類型中是不同的，提示了hnRNP-Q可變剪接調(diào)節(jié)很可能影響細(xì)胞功能。 此外，為了研究hnRNP-Q在視網(wǎng)膜細(xì)胞中通過ARE序列對(duì)c-fos mRNA的穩(wěn)定性調(diào)控作用，我們對(duì)R28細(xì)胞進(jìn)行了hnRNP-Q/GFP-ARE共轉(zhuǎn)染分析，結(jié)果顯示hnRNP-Q不同亞型對(duì)于ARE-RNA沒有顯著的影響。這提示hnRNP—Q不調(diào)節(jié)視