登革熱不同基因型及登革與寨卡血清抗體交叉反應(yīng)特征.pdf

1、研究背景：
　　2014年廣東省爆發(fā)了1型登革熱疫情,2015年出現(xiàn)了2型登革病毒（DENV2）流行。2016年，隨著寨卡病毒（ZIKV）在美洲地區(qū)爆發(fā)流行，中國(guó)也發(fā)現(xiàn)了輸入性病例。目前認(rèn)為ADE效應(yīng)是重癥登革發(fā)生的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，但DENV或ZIKV感染后宿主的免疫狀況仍不清。
　　登革病毒共有四種血清型（DENV1-4）,同一血清型因病毒株序列的差異又可被分為不同的基因型。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)2014年爆發(fā)的登革熱疫情中有兩

2、種不同的基因型同時(shí)流行，不同的基因型間是否存在血清抗體的交叉反應(yīng)？新發(fā)的ZIKV感染常與DENV出現(xiàn)在同一地區(qū)。ZIKV在序列和結(jié)構(gòu)上與DENV有高度同源性，其中DEVN2 E蛋白序列與ZIKV一致性高達(dá)54％，這種高度同源性可引起免疫學(xué)上的交叉反應(yīng)。
　　研究?jī)?nèi)容及目的：
　　本文首先探討DENV1血清型不同基因型感染機(jī)體后血清抗體的產(chǎn)生，揭示登革熱同一血清型不同基因型間血清抗體交叉反應(yīng)的變化；并進(jìn)一步以2015年潮州地區(qū)

3、DENV2病人及本院收治的ZIKA病人為研究對(duì)象，分析登革熱和寨卡病毒誘導(dǎo)宿主抗體產(chǎn)生及交叉反應(yīng)的特征。
　　研究方法：
　　1.DENV1,2型及ZIKV重組E蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達(dá)
　　C端帶標(biāo)簽的DENV1(GenotypeⅣ和GenotypeⅠ)、DENV2和ZIKA重組E蛋白的表達(dá)采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系。從病人急性期血清提取病毒RNA，用RT-PCR法或兩步PCR法擴(kuò)增病毒E蛋白膜外區(qū)，克隆到質(zhì)粒pcDN

4、A3.1構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)序列驗(yàn)證的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲含重組E蛋白的細(xì)胞上清，直接進(jìn)行下一步捕獲ELISA。
　　2.捕獲ELISA的建立
　　用抗標(biāo)簽的抗體捕獲293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清中的E蛋白，建立捕獲ELISA法。
　　3.血清抗體與重組病毒E蛋白結(jié)合分析
　　1）用建立的ELISA法檢測(cè)36例DENV1感染者病程不同時(shí)期血清與GenotypeⅣ、GenotypeⅠE蛋白的結(jié)合反應(yīng),血清樣品以1:1000

5、稀釋開(kāi)始,10倍系列稀釋,共5個(gè)稀釋度。
　　2）30例DENV2感染者和3例ZIKV感染者血清抗體分別與ZIKV,DENV1和DENV2 E蛋白結(jié)合反應(yīng)。血清樣品以1:100稀釋開(kāi)始，3倍系列稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度。
　　研究結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建ZIKV,DENV1和DENV2重組E蛋白表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)序列驗(yàn)證，表達(dá)蛋白大小約56KD。以表達(dá)的E蛋白建立了可用于血清抗體檢測(cè)的捕獲ELISA法。
　　2.在檢測(cè)的3

6、6例DENV1型病例中，病程不同時(shí)期的血清與GenotypeⅣ和GenotypeⅠE蛋白均有明顯的結(jié)合反應(yīng)，在病程后期血清表現(xiàn)更強(qiáng)的抗體結(jié)合反應(yīng)（P=0.038）。
　　3.在檢測(cè)的30例DENV2型住院病例中，大部分病例(24/30)血清與DENV1和ZIKV E蛋白有明顯的結(jié)合反應(yīng)，表現(xiàn)為3種不同的結(jié)合形式,DENV1＞ZIKA(4/30),DENV1＜ZIKA(11/30)和DENV=ZIKA(9/30)。在檢測(cè)的3例ZIK