登革Ⅱ型病毒E蛋白基因原核及真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文登革Ⅱ型病毒E蛋白基因原核及真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建姓名：李東英申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：曲傳智安靜20060501塑型盔堂!!些墮堡土翌窒生堡苧塑鐾塞芋II型病毒E蛋白基因原核及真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建分子量約為60kD。黃病毒屬病毒的E蛋白既是病毒的吸附蛋白，介導(dǎo)病毒與細(xì)胞表面受體的特異性結(jié)合，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的主要抗原。其高級結(jié)構(gòu)的研究顯示E蛋白分3個功能區(qū)域：DomainI、Ⅱ、III，其

2、中DomainI誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性非中和抗體，DomainII介導(dǎo)病毒的膜融合并誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉反映性中和及非中和的抗體，DomainⅡI識別結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體，是病毒與宿主細(xì)胞吸附的關(guān)鍵區(qū)域。目前通過對E蛋白的分析，尋找只產(chǎn)生保護(hù)抗體而不產(chǎn)生增強(qiáng)感染作用，又能激活抗病毒感染所必需的特異性細(xì)胞免疫的決定簇研制，是DV新型疫苗研究的重要候選分子，也是探討DV致病機(jī)理、從中尋找治療突破口的靶點(diǎn)。prM是膜蛋白M的前體，該蛋白除具有極好的抗原功能

3、區(qū)外，還有助于E蛋白的成熟和穩(wěn)定，當(dāng)prM和E基因共同表達(dá)時，E蛋白具有與天然結(jié)構(gòu)類似的三維構(gòu)象。因此，prM和E基因是新型疫苗研究的重要靶標(biāo)?；谝陨系恼J(rèn)識，本實(shí)驗(yàn)以分子生物學(xué)的方法克隆出登革病毒2型(DengIlevinlstype2，DV2)Trl751株prM—E基因和E蛋白的基因，構(gòu)建了原核重組質(zhì)粒pGEX6P1E和真核重組質(zhì)粒pIREsllrGFPla—E，為進(jìn)一步制各登革病毒E蛋白抗體及疫苗，研究DV的致病機(jī)理等積累實(shí)驗(yàn)材

4、料。材料與方法：本實(shí)驗(yàn)登陸GenBank找到登革II型病毒Trl751株的prME基因和E蛋白的cDNA序列，利用生物軟件分析后各自設(shè)計(jì)一對特異性引物，通過ImPcR擴(kuò)增出prME基因和E蛋白的基因序列，分別將其插入克隆載體pMD19simplevector中，各自命名為pMDl9一E和pMDl9E，經(jīng)鑒定正確后，pMDl9一E與真核表達(dá)載體pmEshrGFP1a連接，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pl砌強(qiáng)一hrGFPlaE，pMDl9E與原核表達(dá)載體

5、pGEx6P1連接，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pGEx6P1E，。對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，結(jié)果正確后測序，并通過生物軟件對E蛋白基因進(jìn)行序列分析和比較。結(jié)果：①通過酶切和特異性PCR鑒定，表明重組質(zhì)粒pMDl9一E和pGEx6P1E已成功構(gòu)建。測序的結(jié)果表明所克隆的E蛋白的核苷酸片段為1485bp，編碼495個氨基酸，所克隆的核苷酸片段與GellBank中報道序列相似性993％，氨基酸序列相似性為985％。②通過酶切和特異性PCR鑒定，表明重組質(zhì)粒pM