人水通道蛋白4重組質(zhì)粒的構(gòu)建及在HKE293細胞中的穩(wěn)定表達.pdf

1、目的:視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitisoptica，NMO)，又名Devic綜合征，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centralnervoussystem，CNS）一種嚴重的特發(fā)性炎癥性脫髓鞘性疾病，主要表現(xiàn)為單相或復(fù)發(fā)病程的視神經(jīng)炎和橫貫性脊髓炎。典型特征為病情反復(fù)發(fā)作，預(yù)后較差。NMO的發(fā)病機制尚不明確。在北美，非白種人口中NMO患者比例比經(jīng)典MS(multiplesclerosis,MS)患者的高。在亞洲，視神經(jīng)脊髓型MS是一種常見的炎

2、性脫髓鞘疾病，在日本它大約占MS的5-40％。亞洲的視神經(jīng)脊髓型MS和西方的NMO是同一疾病實體嗎？很多呈現(xiàn)NMO初期癥狀的患者被誤診為MS，但這兩種疾病的預(yù)后和最佳治療方案不同。NMO的臨床表現(xiàn)較MS嚴重且預(yù)后差。第一次發(fā)病后的5年內(nèi)，約50％的患者需要協(xié)助行走，約62％的患者至少一只眼睛失去功能性視力甚至失明，約15-30％的患者死于高頸段脊髓炎誘發(fā)的呼吸衰竭和腦干參與的致命性自主神經(jīng)失調(diào)。免疫抑制藥物被認為是NMO的最佳治療，而免

3、疫調(diào)節(jié)藥物是目前推薦的用于早期MS的有效治療。直到NMO-IgG被發(fā)現(xiàn)，其靶抗原為CNS中的水通道蛋白4(AQP4)。AQP4自身抗體的檢測在NMO和MS的鑒別診斷中可能發(fā)揮重要作用，Wingerchuk新修訂的NMO診斷標準更把其作為支持診斷的一個重要指標，但AQP4自身抗體檢測的低敏感性和特異性仍是待解決的重要問題。
　　本研究試圖構(gòu)建人AQP4的重組質(zhì)粒，并檢測其融合蛋白在人胚腎細胞系（HEK293）中的表達，為日后檢測NM

4、O患者血清中的AQP4抗體提供一種高敏感性和特異性的實驗方法，初步將NMO和MS鑒別開來，使臨床治療更具有針對性和個體化，并可進一步深入挖掘NMO的可能發(fā)病機制，為疾病活動、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)歸的預(yù)測提供有意義的基礎(chǔ)實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、人AQP4基因的獲取
　　1.1引物設(shè)計合成:參照Genebank公布的人AQP4基因序列，分別設(shè)計其上下游引物，上游引物含NheⅠ酶切位點，下游引物含XhoⅠ酶切位點。以內(nèi)參β-肌動

5、蛋白(β-actin)作為陽性對照。
　　1.2腦組織中總RNA的提取:腦組織取自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)患者，采用Trizol法提取其總RNA，提取產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并測定其純度和濃度。
　　1.3RT-PCR擴增AQP4基因:利用隨機引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄為eDNA，再以cDNA為模版，利用AQP4特異性上下游引物將cDNA擴增為DNA，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定和純化。
　　2、重組質(zhì)粒的

6、構(gòu)建
　　AQP4亞型a和空質(zhì)粒pEGFP-N1分別以限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ雙酶切過夜，鑒定酶切產(chǎn)物并回收純化。將酶切純化的AQP4和pEGFP-N1用T4連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞——大腸桿菌DH5α，在硫酸卡那霉素抗性LB平板培養(yǎng)過夜，同時以轉(zhuǎn)化pEGFP-N1作為對照。挑取單克隆后擴大培養(yǎng)，然后用質(zhì)粒提取試劑盒抽提重組質(zhì)粒。
　　3、重組質(zhì)粒的鑒定
　　3.1酶切鑒定:將獲得的重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒

7、分別進行單酶切和雙酶切，所得產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳以檢測重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后是否可切出完整AQP4基因。
　　3.2測序鑒定:將獲得的重組質(zhì)粒送上海生工測序，測序結(jié)果與GenBank中人AQP4序列進行比對。
　　4、細胞轉(zhuǎn)染、鑒定及篩選穩(wěn)定表達細胞株
　　4.1HEK293細胞的轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前一天，將合適數(shù)量的細胞接種至24孔板，常規(guī)培養(yǎng)至70％～80％細胞融合，通過Lipofectamine2000介導(dǎo)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到

8、HEK293細胞，同時轉(zhuǎn)染pEGFP-N1為對照。
　　4.2檢測綠色熒光蛋白(GFP)的表達:轉(zhuǎn)染48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染處理組的GFP表達情況。
　　4.3轉(zhuǎn)染細胞的篩選:轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)24h后觀察瞬時轉(zhuǎn)染效率，同時將800mg/L的G418加入培養(yǎng)液，兩周后篩選出穩(wěn)定表達株，觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染率。聯(lián)合應(yīng)用流式細胞儀分選提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染率。
　　5、鑒定AQP4在HEK293細胞中的表達

9、>　　分別采用RT-PCR、WesternBlot、間接免疫熒光法鑒定AQP4在HEK293細胞中的基因和蛋白水平的表達情況，進一步將固定的細胞置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，確定穩(wěn)定表達細胞株融合蛋白是否具有膜定位效應(yīng)。
　　結(jié)果:
　　1、RT-PCR擴增人AQP4基因:RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖可見清晰的特異性擴增條帶，與理論預(yù)期值相符。
　　2、重組質(zhì)粒的鑒定:重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后在理論

10、預(yù)期值處可見一特異性條帶，單酶切產(chǎn)物未見條帶;測序結(jié)果與理論序列符合率大于99％。
　　3、轉(zhuǎn)染細胞的鑒定及篩選:重組質(zhì)粒組可見GFP表達且熒光主要位于細胞膜上，空質(zhì)粒組可見GFP表達且熒光主要位于包漿中，未轉(zhuǎn)染處理組未見GFP表達;G418抗生素聯(lián)合流式細胞儀篩選使穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率達90％以上。
　　4、鑒定AQP4在HEK293細胞中的表達:RT-PCR檢測AQP4的表達:RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，在972b

11、p處可見一條特異性條帶;WesternBlot檢測AQP4的表達:在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞中提取的蛋白經(jīng)WB檢測分析，在61KD的位置出現(xiàn)特異性條帶，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細胞未見特異性條帶;間接免疫熒光法檢測AQP4的表達:熒光顯微鏡下觀察進行抗原抗體反應(yīng)后的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細胞，藍光激發(fā)時細胞表面呈綠色熒光，綠光激發(fā)時細胞表面呈現(xiàn)為紅色熒光，兩者于細胞膜位置重合良好;AQP4-GFP融合蛋白的細胞定位:激光共聚焦顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞內(nèi)綠