人ZP4重組子在真核系統(tǒng)中的表達及線粒體DNA多態(tài)性的調(diào)查.pdf

1、目的:研究目的之一:人類卵膜糖蛋白4(zona pellucidaⅣ，ZP4)基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組質(zhì)粒在真核細胞中的表達及細胞內(nèi)的定位，從而為后續(xù)ZP4與精子結(jié)合的研究提供基礎。研究目的之二:探究中國北方人群線粒體DNA基因編碼區(qū)多態(tài)性及與帕金森病(Parkinson's disease，PD)的關(guān)聯(lián)性。
　　研究方法:合成含有人ZP4完整編碼區(qū)的DNA，將合成的ZP4基因編碼區(qū)DNA與真核表達質(zhì)粒pCDNA3.1(+)進行重

2、組，同時重組質(zhì)粒中引入His序列標簽。取構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落進行培養(yǎng);從大腸桿菌中提取DNA，選擇特異性限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進行鑒定，最后采用DNA測序方法對插入序列的完整性及準確性進行鑒定。應用質(zhì)粒DNA提取試劑盒分離純化構(gòu)建的pCDNA3.1(+)-ZP4-His重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293細胞進行體外過表達研究;收集分別轉(zhuǎn)染了pCDNA3.1(+)-His和pCDNA3.1(+)-ZP4-His的HEK29

3、3細胞及對應的培養(yǎng)基，采用免疫印跡技術(shù)(western blot)檢測過表達的重組ZP4蛋白;同時，研究也對過表達ZP4的HEK293細胞進行固定，采用免疫熒光技術(shù)觀察ZP4在HEK293中的亞細胞定位。
　　對于線粒體DNA多態(tài)性的分析，本研究收集了中國北方地區(qū)353例PD患者和389名健康個體的血液樣本，采用酚氯仿方法抽提了所有樣本的基因組DNA，應用復合PCR擴增和限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析方法，對人類線粒

4、體DNA編碼區(qū)ND1基因上T4216C、ND2基因上A4917G、ND4基因上A11084G、tRNA(L2)基因上A12308G、ND5基因上A13966G、tRNA(Thr)基因上G15928A共6個位點進行遺傳多態(tài)性調(diào)查，針對所有位點的頻率數(shù)據(jù)，本研究探討了與PD的潛在相關(guān)性，并且對性別分層也進行了分析。
　　結(jié)果:以合成的人完整編碼區(qū)DNA序列為目的片段，選擇含有His標簽序列的真核表達載體pCDNA3.1(+)，本研究成

5、功構(gòu)建了pCDNA3.1(+)-ZP4-His真核表達重組質(zhì)粒。為了進一步探討構(gòu)建的ZP4重組質(zhì)粒是否能夠在真核細胞中表達，本研究將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細胞，轉(zhuǎn)染后分別收集細胞及培養(yǎng)基，采用標簽抗體和特異性抗體的Western blot分析后，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染人ZP4重組質(zhì)粒的細胞成功表達了含有ZP4的融合蛋白，值得一提的是，培養(yǎng)基中也檢測到了ZP4蛋白，提示重組ZP4蛋白不僅可以有效的在真核細胞中表達，而且該蛋白顯示出明顯的外

6、分泌特征。為了進一步了解重組ZP4蛋白在細胞內(nèi)的表達定位，對于過表達的重組蛋白本研究采用了免疫熒光技術(shù)進行分析，結(jié)果顯示，特異性抗體結(jié)合的重組ZP4主要分布在細胞胞質(zhì)內(nèi)，提示為過表達的ZP4融合蛋白，但實驗中并未見明顯的細胞膜分布。此外，相對于人體卵細胞的ZP蛋白胞周圍分布特征，本研究中檢測到的為培養(yǎng)基中存在一定量的分泌，兩種不同分布特性之間的關(guān)聯(lián)需進一步研究證明。
　　本研究采用PCR和錯配PCR-RFLP方法，復合擴增和酶切結(jié)

7、合，成功地對人類mtDNA編碼區(qū)上的6個遺傳多態(tài)性位點進行了分型;基于得到的各位點的等位基因分型及頻率數(shù)據(jù)，研究也獲得了所有單倍型數(shù)據(jù)。其中，對性別進行分層后，發(fā)現(xiàn)女性群體中A11084G多態(tài)性位點等位基因G的頻率和6個位點組成的單倍型(4216T-4917A-11084G-12308A-13966A-15928G)的頻率PD組均較對照組高，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而其它位點單倍型進行統(tǒng)計學分析，其多態(tài)性分布在中國北方PD組