重組人凝血因子VIII表達質(zhì)粒的構(gòu)建及其在HepG2細胞中的表達.pdf

1、目的：血友病A是由于遺傳性凝血因子Ⅷ基因缺陷，造成血漿凝血因子Ⅷ含量不足或功能缺陷，引起的一組終身出血的凝血障礙性疾病[1，2]。凝血因子Ⅷ是治療血友病的唯一有效用藥，它的生產(chǎn)原料就是血漿，而血漿的嚴重不足造成了目前凝血因子Ⅷ一藥難求的局面，也使有些患者不治而亡。
　　血友病A的治療主要包括血漿來源的凝血因子Ⅷ(plasma-derived FⅧ，pdFⅧ)和重組凝血因子Ⅷ(recombinant FⅧ，rFⅧ)制劑[3]。重組凝

2、血因子Ⅷ制劑的問世是血友病治療史上的一大突破[4]，由于生產(chǎn)工藝繁瑣、價格昂貴其生產(chǎn)僅限于發(fā)達國家[5]。目前國內(nèi)對血友病A的治療仍以血漿凝血因子Ⅷ濃縮劑為主，然而接受這類血液制品的患者其感染病毒性肝炎及艾滋病等傳染性疾病的風(fēng)險較高。重組凝血因子Ⅷ在生化、免疫、凝血活性及藥物動力學(xué)等方面與血漿來源的凝血因子Ⅷ無明顯差別，但其在純度、抗原性、安全性、無自身血源性病毒感染等方面具有血漿來源的凝血因子Ⅷ無法比擬的優(yōu)點，具有良好的應(yīng)用前景。面對

3、目前國內(nèi)凝血因子Ⅷ的短缺，利用基因工程生產(chǎn)重組凝血因子Ⅷ成為解決其短缺的一個重要方法。B區(qū)缺失型(△760aa-1639aa)人凝血因子Ⅷ(B domain-deleted human FⅧ，BDDhFⅧ)與野生型凝血因子Ⅷ具有相同的生物學(xué)特性，但B區(qū)缺失型凝血因子Ⅷ卻解決了載體包裝容量的限制，且表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)更為簡單[1，2，6]。本研究通過構(gòu)建含有BDDhFⅧ的真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2細胞使其穩(wěn)定表達人凝血因子Ⅷ。
　　方

4、法：參照GenBank人凝血因子Ⅷ基因序列設(shè)計引物并加入限制性內(nèi)切酶位點及6個組氨酸。PCR擴增產(chǎn)物和pcDNA4/v5-his空載體分別經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切，0.7％瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后將BDDhFⅧ基因片段插入pcDNA4/v5-his空載體中構(gòu)建pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ重組真核表達質(zhì)粒，測序正確后電轉(zhuǎn)入HepG2細胞。同時 pcDNA4/v5-his空載體電轉(zhuǎn)入HepG2細胞作為對照組。HepG2細胞經(jīng)

5、300μg/ml Zeocin篩選構(gòu)建穩(wěn)定細胞株，并分別收集24 h，48 h，96 h及144 h HepG2細胞培養(yǎng)液Ni-NTA純化，利用Western blot檢測凝血因子Ⅷ在HepG2細胞中的表達。
　　結(jié)果：經(jīng)限制性酶切和測序鑒定，成功構(gòu)建了pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ重組真核表達質(zhì)粒。在電擊轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，通過Western blot檢測證實，成功在HepG2細胞表達約160KD的重組人凝血因子Ⅷ。

6、分別在24 h，48 h，96 h及144 h，收集pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ轉(zhuǎn)染HepG2細胞構(gòu)建的穩(wěn)定細胞系培養(yǎng)液，經(jīng)Western blot檢測可見，96h時細胞培養(yǎng)液中重組蛋白分泌最多，而144h時重組蛋白出現(xiàn)部分降解。故收集96h pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ轉(zhuǎn)染組及空載體pcDNA4/v5-his轉(zhuǎn)染組HepG2細胞培養(yǎng)液進行Ni-NTA純化，純化樣本變性后Western blot檢測經(jīng)光密度比對可

7、見pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)液Ni-NTA純化后條帶明顯比未純化的HepG2細胞培養(yǎng)液的條帶密度高。且洗脫液2(Elution2)是光密度值最高的，而空載體pcDNA4/v5-his轉(zhuǎn)染組未見條帶。
　　結(jié)論：本實驗選擇載體pcDNA4/v5-his構(gòu)建含有BDDhFⅧ的重組真核表達質(zhì)粒pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ，利用電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入HepG2細胞，獲得表達人凝血因子Ⅷ的穩(wěn)定細胞株，并通過純化