京尼平的微生物制備及其作為交聯(lián)劑的應(yīng)用研究.pdf

1、梔子是茜草科(Rubiaceae)梔子屬(Gardenia)植物，是一味常用中藥，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等作用。據(jù)梔子中主要藥理藥效成分的研究報(bào)道：梔子中起主要藥效作用的主要成分是梔子苷元一京尼平。但是京尼平在梔子史的盒量很低，約為0.005％～0.01％，主要是以其前體形式一一京尼平苷形式存在，含量約為3％～5％。因此如何提高京尼平的含量成為當(dāng)今乃至今后研究的重點(diǎn)。 在文獻(xiàn)報(bào)道中提高梔子中京尼平含量的方法主要有酶解法

2、，但其存在一些缺陷，如酶以及京尼平苷價(jià)格昂貴等，未能應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。本論文通過微生物發(fā)酵法實(shí)現(xiàn)對(duì)京尼平苷的轉(zhuǎn)化，無需將酶及京尼平苷提純，因此有效的避免了上述方法存在的缺陷。 京尼平的不僅具有重要的藥效作用，還可以作為一種新型的生物材料交聯(lián)劑。它不僅能形成穩(wěn)定的交聯(lián)制品，還具有細(xì)胞毒性小，生物相容性好，抗降解能力強(qiáng)和應(yīng)用領(lǐng)域廣泛等優(yōu)點(diǎn)，是非常有前途的交聯(lián)劑。 本研究的主要研究?jī)?nèi)容以及結(jié)果如下： Ⅰ、轉(zhuǎn)化京尼平苷的菌

3、種篩選：篩選、分離具有轉(zhuǎn)化京尼平苷為京尼平的高轉(zhuǎn)化菌株，并對(duì)菌種進(jìn)行鑒定。以梔子果粉為碳源建立的篩選模型，分離到具有轉(zhuǎn)化京尼平苷為京尼平的β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株。經(jīng)過對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物TLC和HPLC分析，得到一株優(yōu)良菌株GP-4，此菌株具轉(zhuǎn)化專一性、高效性。 Ⅱ、微生物發(fā)酵梔子條件的優(yōu)化：優(yōu)化發(fā)酵工藝，得到最佳轉(zhuǎn)化參數(shù)，提高生產(chǎn)菌種的轉(zhuǎn)化水平，獲得更多的目的產(chǎn)物。以轉(zhuǎn)化后京尼平含量為指標(biāo)，分別從對(duì)發(fā)酵溫度、底物濃度、裝液量、轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)化

4、時(shí)間等幾方面進(jìn)行望因素實(shí)驗(yàn)，叢而確定京尼平苷轉(zhuǎn)化的最佳條件，使京尼平苷最大程度的轉(zhuǎn)，化為京尼平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是：將使用玉米糖化液培養(yǎng)得到的菌種，洗滌后接入到京尼平苷濃度為1.5％、(NH<,4>)<,2>SO<,4> 0.1％、MgSO<,4> 0.1％、KH<,2>PO<,4> 0.2％、pH自然的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速150 rpm、裝液量40％、溫度28℃、轉(zhuǎn)化時(shí)間30小時(shí)。經(jīng)此條件京尼平苷轉(zhuǎn)化率最高，可達(dá)到98％以上。 Ⅲ、微生

5、物發(fā)酵梔子的動(dòng)力學(xué)研究：通過對(duì)發(fā)酵過程中碳源、氮源、菌體量、β-葡萄糖苷酶酶活、京尼平苷以及京尼平含量的變化，探討發(fā)酵過程中影響京尼平苷轉(zhuǎn)化為京尼平的主要因素及其動(dòng)力學(xué)的基本特征。進(jìn)而為發(fā)酵過程的參數(shù)控制和發(fā)酵規(guī)模的擴(kuò)大提供重要的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)。 Ⅳ、京尼平的分離提取及其結(jié)構(gòu)鑒定：建立分離純化京尼平的工藝路線，并對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。篩選出D141和HPD300的混合樹脂用于京尼平的吸附，并通過一系列的系統(tǒng)行為調(diào)控試驗(yàn)，最終得

6、到了京尼平的最佳提取工藝：京尼平濃度為2mg/ml，加入NaCl 5％，并調(diào)pH為4，以4.8BV/h的速度通過D141：HPD100=8：5的混合大孔吸附樹脂，到達(dá)泄漏點(diǎn)時(shí)停止上樣，然后用丙酮：乙醇=1：1的洗脫劑洗脫至無京尼平檢出為止。通過大孔吸附樹脂結(jié)合硅膠柱層析分離法分離出京尼平結(jié)晶純度為95％以上。經(jīng)HPLC、UV、IR、HNMR鑒定分離白色針狀結(jié)晶為京尼平。 Ⅴ、京尼平作為交聯(lián)劑的應(yīng)用研究：通過測(cè)定不同交聯(lián)條件制各的