京尼平交聯(lián)羊膜的制備、體外性能及治療角膜堿燒傷的實驗研究.pdf

1、目的：
　　研制一種新型的脫細胞羊膜制品-京尼平交聯(lián)羊膜，觀察其生物物理性狀及在體外的細胞相容性，并且進一步觀察其有效性，通過對兔角膜急性堿燒傷治療效果的觀察，探討其在修復眼表過程中發(fā)揮作用的機制，為該新型的生物材料的臨床應用提供前期試驗依據。
　　本研究分為三部分：
　　部分一：京尼平交聯(lián)羊膜的制備
　　部分二：京尼平交聯(lián)羊膜的體外性能研究
　　部分三：京尼平交聯(lián)羊膜治療兔角膜急性堿燒傷的實驗研究

2、　　方法：
　　部分一：經一定程序將羊膜用0.5％、1％的京尼平溶液進行交聯(lián)制得京尼平交聯(lián)羊膜，在肉眼下觀察大體外觀、檢測抗縫線撕裂能力、顯微鏡下觀察細微結構，HE染色，掃描電鏡觀察。
　　部分二：按照實驗一的方法，分別隨機選取制備好的新鮮及交聯(lián)羊膜，按實驗進行分組。每一組分別進行檢測：
　　1、厚度測定：濾紙吸干待檢羊膜表面水分，用厚度儀(精度0.01mm)夾住羊膜，適當地加壓，讀出指針讀數
　　2、力學性能測

3、定：在生物材料拉力測試機上對各組樣品羊膜進行單向拉伸，樣品斷裂時，計算機自動輸出抗拉強度(Mpa)、斷裂伸長率(％)、彈性模量(Mpa)及應力-應變曲線等。
　　3、降解率測定：將制備好的兩種樣品羊膜在室溫下自然風干，并剪取同樣大小的相等數量的兩種羊膜數片，在固定的時間點分別稱量其浸入膠原酶溶液前后的質量M0，M1，降解率=(M0-M1/M0)％，
　　4、體外細胞毒性試驗：將京尼平交聯(lián)羊膜按一定面積容量比(1cm2/1ml

4、)浸入細胞培養(yǎng)液中72h獲取京尼平羊膜的浸提液，以該浸提液代替常用細胞培養(yǎng)液，以常用細胞培養(yǎng)液組作為對照，培養(yǎng)相同密度小鼠成纖維細胞，于培養(yǎng)的2、4、7天行MTT，計算RGR
　　部分三：60只健康新西蘭大白兔，均無眼部病變。以右眼造堿燒傷模型(重度)后隨機分成3組，每組20只。A組：燒傷后移植G-HAM。B組：燒傷后移植AM。C組：不做任何處理，對照組，僅滴眼藥水。術后每天觀察眼表大體狀況，羊膜脫落時間。從第7天開始，每周觀察術

5、眼角膜混濁度和新生血管并對兩者評分。同時取角膜HE染色。
　　結果：
　　部分一：京尼平交聯(lián)后的羊膜肉眼下見：外觀呈淡藍色半透明膜，鑷子提起時較易成型，不易卷曲、撕裂，質地柔韌。電鏡下可見交聯(lián)后的羊膜膠原之間的聯(lián)系更加致密，結構未改變。
　　部分二：1、組織厚度測定結果顯示，京尼平交聯(lián)后的羊膜平均厚度(0.040±0.009)mm，新鮮羊膜平均厚度(0.038±0.010)mm，京尼平交聯(lián)羊膜略有增厚，但差異無統(tǒng)計學意

6、義(p>0.05)
　　2、兩組羊膜生物力學性能測定結果：京尼平交聯(lián)羊膜的最大應力、抗拉強度，斷裂伸長率，彈性模量與新鮮脫細胞羊膜的最大應力、抗拉強度，斷裂伸長率，彈性模量相比具有增加，且差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　3、第一天觀察結束時，AM已不成膜形，完全溶解，彌散在消化液中。G-HAM仍可見，外觀未發(fā)生變化，重量基本上沒有變化，降解率：Dayl(4.48±0.86)％，Day3(4.96±1.39)％，Day

7、5(9.44±2.67)％。Weekl(15.25±4.08)％，Week2(34.93±6.07)％，Week3(50.49±4.77)％，Week4(74.62±3.81)％。
　　4、京尼平交聯(lián)羊膜體外細胞毒性：按照國標“GB/T16886.5-2003”的規(guī)定，京尼平交聯(lián)羊膜體外細胞毒性分級0～1級，無或低細胞毒性，符合生物材料要求。
　　部分三：每只眼均為重度堿燒傷，總共參與實驗兔眼54只，相應觀察結果如下：

8、>　　1、京尼平交聯(lián)羊膜完全溶解脫落的時間為20.00±10.418d，而普通羊膜為9.20±10.618d，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，
　　2、術后14、28、42天，京尼平交聯(lián)羊膜組CNV評分與對照組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，術后14、28、42天，普通羊膜組CNV評分與對照組差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。
　　3、術后14d，京尼平交聯(lián)羊膜組與普通羊膜組角膜渾濁度評分與對照組差異均無統(tǒng)計學意義(p

9、1>0.05，p2>0.05)；術后28、42d，京尼平羊膜組與普通羊膜組角膜渾濁度評分與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而G-HAM組與AM組角膜渾濁度評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)
　　4、在1個半月的觀察期，分別有1只眼(AM組)和3只眼(control組)發(fā)生角膜穿孔，排出實驗。
　　結論：
　　1、京尼平交聯(lián)羊膜具有良好的生物力學特性，其柔韌性和可塑性優(yōu)于單層羊膜，其在厚度沒有增加的情況下

10、，可延長在眼表的停留時間，并且沒有細胞毒性。因此，京尼平交聯(lián)羊膜是一種能克服傳統(tǒng)羊膜所存在的缺點的新型生物材料。
　　2、治療角膜化學性堿燒傷，京尼平交聯(lián)羊膜與普通新鮮羊膜相比，它在抑制新生血管以及減輕角膜混濁方面效果更顯著。后期新生成的角膜上皮也更穩(wěn)定，排列更規(guī)則。另外它發(fā)生溶解的時間明顯延長，能在角膜創(chuàng)面覆蓋更久，既覆蓋了創(chuàng)面又給角膜細胞的再生提供了一個良好的生物支架，從而達到修復眼表的目的。
　　3、京尼平交聯(lián)羊膜具有