氬氦冷凍治療荷9L膠質瘤鼠的療效及其樹突狀細胞的初步研究.pdf

1、研究背景
　　 膠質瘤是顱內最為常見的惡性腫瘤。雖然現(xiàn)在對于膠質瘤的治療包括手術、放療、化療等治療，膠質瘤患者的預后仍然非常差。免疫治療因能夠直接作用于腫瘤細胞目前成為比較有前景的治療新方法。這種方法能夠維持長期的抗腫瘤免疫反應，同時沒有任何神經系統(tǒng)副作用。
　　 氬氦冷凍治療技術是近年源自美國氬氦冷凍治療設備而興起的一種低溫冷凍技術。目前，此項治療技術發(fā)展迅速，因為它操作簡單，靶向性強，適應癥廣，加之治療過程中靶區(qū)可以

2、適時監(jiān)測，對病人損傷小，消融效果確切。已經成為無法外科根治性切除的實體腫瘤患者治療的最佳手段之一，極大的推動了臨床腫瘤治療學的進步，顯著改善了腫瘤患者的治療條件、生存狀況和預后。隨著近年來氬氦冷凍在全世界范圍內的開展，它可對多種良惡性腫瘤施行精確冷凍治療，尤其在肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎腫瘤、乳腺癌等治療領域已廣泛應用于臨床。資料顯示冷凍治療效果不僅在于超低溫直接殺傷腫瘤細胞，更重要的是激活機體抗腫瘤免疫系統(tǒng)。
　　 許多

3、文獻顯示腫瘤通過氬氦刀治療后能夠有效的在體內傳遞抗原激活自身免疫系統(tǒng)。樹突狀細胞是最強的抗原呈遞，它在誘導免疫方面起著至關重要的作用。目前在體外培養(yǎng)并通過腫瘤抗原致敏的成熟樹突狀細胞已作為腫瘤疫苗用于臨床。但是，體內抗原刺激形成的成熟樹突狀細胞是最為便利的樹突狀細胞疫苗。
　　 在顱內膠質瘤治療中，對于那些對化學治療和放射治療無效或不適宜手術治療的病人，氬氦冷凍治療為這些患者提供了一個有效的方法，但這一技術在顱內膠質瘤手術中的應

4、用還不夠成熟，臨床上有少量的病例報道認為其對膠質瘤的療效較好，但尚缺乏必要的基礎研究和動物實驗。本研究擬建立荷9L膠質瘤的F344大鼠動物模型，并進行氬氦冷凍治療，觀察腫瘤細胞病理以及樹突狀細胞的免疫變化情況，為其臨床進一步應用提供理論依據(jù)。
　　 第一章9L/Fischer344大鼠腦膠質瘤模型及氬氦冷凍模型的建立及生存期觀察
　　 目的
　　 1.成功建立膠質瘤大鼠模型。
　　 2.觀察氬氦冷凍治療荷

5、腦膠質瘤鼠前后膠質瘤細胞形態(tài)學變化。
　　 3.空白對照組、手術切除組、氬氦冷凍組腫瘤生長情況及生存期觀察。
　　 方法
　　 1.9L腦膠質瘤細胞的凍存和復蘇;種植9L膠質瘤細胞于F344大鼠鼠背;荷腦膠質瘤F344大鼠模型的建立;膠質瘤標本制片，腫瘤組織病理學觀察，GFAP和S-100蛋白免疫組織化學檢測;動物模型的分組（空白對照組、手術切除組、氬氦冷凍治療組）。
　　 2.各組膠質瘤大鼠的形態(tài)和病理

6、學變化，觀察荷腦膠質瘤大鼠;HE染色，電鏡觀察冷凍消融的腫瘤組織的形態(tài);分別在干預治療前、術后游標卡尺測量并計算、分析比較各組腫瘤的體積變化，以及各組大鼠生存期的觀察。
　　 3.統(tǒng)計學分析:Kaplan-Meier生存分析描繪各組模型大鼠生存曲線;腫瘤體積的變化比較采用重復測量的方差分析。
　　 結果
　　 1.光鏡下腫瘤細胞巢狀排列緊密，腫瘤無包膜，瘤周小血管擴張，可見腫瘤細胞沿小血管浸潤生長;瘤內新生血管豐

7、富，瘤內常見出血、凝固性壞死灶。高倍鏡下，腫瘤細胞形態(tài)多樣，分化程度低，核大、多核，核質深染，異型性高。GFAP、S-100染色:腫瘤細胞未見染色，腫瘤細胞間膠質網可見陽性染色。
　　 2.氬氦冷凍組在冷凍后，HE染色示:冷凍中央?yún)^(qū)呈均勻性凝固性壞死。邊緣區(qū)包括炎性反應帶、出血水腫帶(HEB)和邊界帶。炎性反應帶主要為一些細胞碎片及大量的紅、白細胞浸潤;緊挨炎性反應帶的是出血水腫帶:微血管內也發(fā)現(xiàn)大量的紅細胞、血小板集合和血栓形

8、成，并可見灶性出血。電鏡示:冷凍區(qū)中央、邊緣區(qū)組織細胞全部壞死或凋亡。
　　 3.9L/Fischer344模型腫瘤持續(xù)生長;動物模型的分組（空白對照組、手術切除組、氬氦冷凍治療組）的大鼠，平均生存時間分別為78.500±1.061、171.000±10.839、252.778±5.013天。各組模型大鼠平均生存時間經log rank檢驗，發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義(x2=12.403，P=0.002)。
　　 4.接種后第3

9、0天空白對照組腫瘤體積達到5.197±0.162 cm3，手術組達到5.002±0.175cm3，氬氦冷凍組5.024±0.159 cm3，3組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(F=0.107，P=0.899)。干預后30天組間效應之間的差別有統(tǒng)計學意義(F=4648.049，P=0.000)，各個測量時間點時腫瘤體積變化顯示有統(tǒng)計學意義(F=1099.806，P=0.000)，兩者之間具有交互作用(F=1531.868，P=0.001)。

10、>　　 結論
　　 1.9L/Fischer344大鼠膠質瘤模型成功建立。該方法建立的大鼠腦膠質瘤模型穩(wěn)定可靠，大鼠腦內腫瘤持續(xù)生長，符合惡性膠質肉瘤生物學特性。模型成功率達100％。
　　 2.該方法簡單、經濟、直視下接種準確，種植腫瘤細胞30天，腫瘤體積便可達5-6cm3，背部便于消融。同時避免因為大鼠顱腔較小，消融后腦水腫造成動物死亡。因此，鼠背荷膠質瘤是氬氦冷凍治療腦膠質瘤的理想動物模型。
　　 3.氬

11、氦刀治療后冷凍區(qū)中央?yún)^(qū)、邊緣區(qū)的神經元細胞全部死亡，未發(fā)現(xiàn)存活的細胞結構，腫瘤逐漸消退，周圍淋巴細胞浸潤，其生存期顯著延長，氬氦刀是治療膠質瘤有效的方法。
　　 第二章氬氦冷凍治療荷腦膠質瘤大鼠的樹突狀細胞的檢測
　　 目的
　　 評定氬氦冷凍治療組并與空白對照組、手術切除組比較荷腦膠質瘤大鼠的樹突狀細胞數(shù)目及成熟度的改變。
　　 方法
　　 1.9L腦膠質瘤細胞的凍存和復蘇;種植9L膠質瘤細胞于

12、F344大鼠鼠背;荷腦膠質瘤F344大鼠模型的建立;動物模型的分組（空白對照組、手術切除組、氬氦冷凍治療組）。
　　 2.免疫組化檢測干預后30天腫瘤組織內CD80+、CD83+、CD86+的表達情況并計數(shù)。
　　 3.免疫組化檢測干預后30天脾臟組織內CD80+、CD83+、CD86+的表達情況并計數(shù)。
　　 4.流式細胞儀檢測干預后30天引流淋巴結組織內CD80+、CD86+的陽性細胞的比例。
　　

13、5.酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測干預后30天外周血中IL-12、IFN-γ細胞因子的變化。
　　 6.各組腫瘤、脾臟、淋巴組織、血清中指標比較采用重復測量的方差分析或單因素方差分析。
　　 結果
　　 1.免疫組化顯示氬氦冷凍治療組腫瘤及脾臟中CD80+、CD83+、CD86+細胞染色氬氦冷凍組較空白對照組及手術組顯著密集(P＜0.05)。
　　 2.流式細胞儀檢測干預后30天引流淋巴結組織內CD80+、CD86

14、+的陽性細胞的比例:氬氦冷凍組＞手術切除組、空白對照組(P＜0.05)。但是空白對照組和手術組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。
　　 3.酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測干預后30天外周血中IL-12、IFN-γ細胞因子的變化:外周血中IL-12:氬氦冷凍組＞手術切除組、空白對照組，比較有顯著差異(P＜0.01)，但手術切除組和空白對照組沒有顯著差異(P＞0.05);血清IFN-γ水平:氬氦冷凍組＞手術切除組、空白對照組，比較有顯著差異(