膠質(zhì)瘤氬氦凍融產(chǎn)物負(fù)載樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的免疫治療研究.pdf

1、研究背景:
　　 膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其在顱腦腫瘤中所占的比例高達(dá)44.69％。近幾十年來在膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域各國均進(jìn)行了深入研究，治療的主流手段仍為手術(shù)，化療和放射治療。盡管部分患者能通過這些療法有一定緩解，但從總體情況看膠質(zhì)瘤的治愈率仍較低，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后極差，中位生存約14個(gè)月。膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，常規(guī)手術(shù)很難找到其明顯邊界，術(shù)后復(fù)發(fā)率很高;大部分腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對放療、化療不敏感，手術(shù)創(chuàng)傷及放化療對機(jī)體免疫力又產(chǎn)生

2、抑制和破壞。
　　 氬氦冷凍治療技術(shù)是近年源自美國氬氦冷凍治療設(shè)備而興起的一種低溫冷凍技術(shù)。利用高科技手段和航天材料制成的帶有微細(xì)刀頭的氬氦冷凍設(shè)備，可在計(jì)算機(jī)的控制下，利用冷熱逆轉(zhuǎn)的原理，達(dá)到破壞腫瘤的作用。即高壓氬氣經(jīng)過冷凍刀傳導(dǎo)，短時(shí)間內(nèi)(10～20秒)在刀尖部位形成-140℃的超低溫，形成似梭形冰塊冷凍組織，腫瘤細(xì)胞瞬間形成冰晶體而死亡。復(fù)溫時(shí)，高壓氦氣達(dá)到刀頭時(shí)迅速升至45℃，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的冰晶體在這一溫度下快速解凍而導(dǎo)

3、致細(xì)胞裂解，對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生二次攻擊，達(dá)到徹底破壞腫瘤組織的作用，而整個(gè)過程刀桿基本保持常溫。由于操作簡單、安全，對病人創(chuàng)傷小，此項(xiàng)治療技術(shù)發(fā)展迅速，已應(yīng)用于臨床各組腫瘤疾病，包括肝、腎、胰腺癌、前列腺痛和肺癌各種組織，是很有前途的技術(shù)。近幾年國內(nèi)外大量基礎(chǔ)和臨床研究發(fā)現(xiàn)冷凍治療技術(shù)不僅能直接殺傷腫瘤，其冷凍后的腫瘤細(xì)胞能作為抗原增強(qiáng)術(shù)后抗腫瘤免疫能力，引發(fā)繼發(fā)性的冷凍免疫反應(yīng)。近來的研究表明，這一機(jī)制與抗原遞呈細(xì)胞（Antigenpre

4、sentingcells，APC）有關(guān)。目前認(rèn)為，腫瘤經(jīng)冷凍破壞后，細(xì)胞膜融解破裂，從而促使細(xì)胞內(nèi)和處于遮蔽狀態(tài)的抗原釋放，抗原遞呈細(xì)胞(APC)通過識別、加工、處理腫瘤抗原并將其信息提供給T細(xì)胞，發(fā)生冷凍免疫效應(yīng)。
　　 樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)是目前所知體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，具有攝取、處理抗原的能力，如腫瘤特異性抗原、腫瘤相關(guān)性抗原及完全性細(xì)胞抗原。經(jīng)過修飾的DC通過把抗原加工成肽，載

5、入第二類主要組織相容性復(fù)合（MHCClassⅡ）分子運(yùn)送到細(xì)胞表面，依賴于共刺激信號和T細(xì)胞受體(TCR)抗原的識別，如T細(xì)胞上的CD28識別DC上的B7.1(CD80)分子或B7.2(CD86)分子，激活特異性T細(xì)胞，激發(fā)初次細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時(shí)成熟DC分泌的白細(xì)胞介素（如白介素12，IL-12）等免疫因子，通過誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng);另外IL-12還可促進(jìn)T和NK細(xì)胞的增殖，提高單核細(xì)胞的

6、細(xì)胞毒性，通過各種途徑殺傷腫瘤細(xì)胞。
　　 近年來，對樹突狀細(xì)胞(DC)的深入研究不僅促使了基礎(chǔ)免疫的進(jìn)展，而且使其在腫瘤免疫治療中的作用越來越受到重視，以DC為基礎(chǔ)的主動(dòng)免疫療法已成為當(dāng)今腫瘤生物治療的熱點(diǎn)之一。其原理為應(yīng)用各種抗原致敏DC使其成為細(xì)胞疫苗再回輸體內(nèi)，通過有效激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答而達(dá)到治療腫瘤的目的，該療法已成為腫瘤生物治療的又一新興手段。
　　 目前用來“裝載”DC的抗原有死亡的腫

7、瘤細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、凋亡體、純化的蛋白質(zhì)和抗原肽，質(zhì)粒cDNA等。由于膠質(zhì)瘤具異質(zhì)化的特性，即膠質(zhì)瘤中的各種瘤細(xì)胞在侵襲能力、生長速度、分化程度、對激素的反應(yīng)、對抗癌藥物的敏感性等方面均有所不同，使得膠質(zhì)瘤特異性抗原的純化分離相當(dāng)困難。且最適當(dāng)?shù)乃拗骺鼓[瘤的T細(xì)胞反應(yīng)需要一系列的抗原決定簇，而不是僅僅局限于某一個(gè)抗原決定簇。不斷有研究表明，利用冷凍制備腫瘤抗原，能誘導(dǎo)出腫瘤特異性的或針對多個(gè)抗原表位的T細(xì)胞反應(yīng)，在臨床應(yīng)用中無需鑒定腫瘤

8、抗原表位及患者人類白細(xì)胞抗原(humanleukocyteantigen，HLA);誘導(dǎo)出的針對腫瘤細(xì)胞多靶位的多克隆免疫應(yīng)答，抗原性更強(qiáng)，能夠有效地防止由于抗原變異而引起的免疫逃避。目前，將腫瘤冷凍抗原作為樹突狀細(xì)胞致敏物，所制備的樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗已成功運(yùn)用于多種其他腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究中。除此之外，我們認(rèn)為利用氬氦冷凍制備的腫瘤冷凍抗原DC疫苗還有制備簡便、效果顯著、應(yīng)用安全的優(yōu)勢。
　　 中樞神經(jīng)系統(tǒng)很長時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為是免疫豁免

9、區(qū)，這主要和存在血腦屏障(BBB)和缺乏淋巴系統(tǒng)有關(guān)。現(xiàn)有證據(jù)表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫豁免不是絕對的，在一定程度上說，腦組織僅是免疫原性低下的器官，在多種病理情況下，血腦屏障受到破壞而開放，淋巴細(xì)胞可以進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用。因此，免疫反應(yīng)可以介入中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，這為中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的免疫治療奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 本研究選用大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系作為研究對象，首先，氬氦冷凍體外C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液，制備成腫瘤全細(xì)胞冷凍抗原

10、。然后，利用全細(xì)胞冷凍抗原，致敏Wistar骨髓源性樹突狀細(xì)胞(DC)，形成樹突狀細(xì)胞(DC)疫苗;最后，建立C6/Wistar大鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤模型，采用DC疫苗對其進(jìn)行治療，觀察DC疫苗對荷腦膠質(zhì)瘤大鼠的療效。
　　 第一部分:氬氦冷凍制備大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凍融抗原
　　 目的:建立大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，常規(guī)雙循環(huán)氬氦冷凍法制備全細(xì)胞凍融抗原。
　　 方法:選擇大鼠C6膠質(zhì)痛細(xì)胞系，應(yīng)用含血清培養(yǎng)基(DMEM/F

11、12+10％FBS)培養(yǎng)足量膠質(zhì)瘤細(xì)胞。收集對數(shù)期生長的細(xì)胞制成大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液，無菌狀態(tài)下，常規(guī)雙循環(huán)氬氦冷凍法制備大鼠膠質(zhì)瘤全細(xì)胞凍融抗原，并于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?br>　　 結(jié)果:大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中呈貼壁生長，長出突起，呈短梭形、長梭形、星形、長纖維形;這些膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)胰酶消化制備成PBS懸液于離心管內(nèi)，常規(guī)氬氦冷凍法制各大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞時(shí)，開啟氬氣能在冷凍探針頂部形成一定范圍的冰球，近似口寬底窄的梭

12、形，開啟氦氣時(shí)冰球溶解。循環(huán)冷凍消融時(shí)再次形成冰球并溶解。
　　 結(jié)論:采用氬氦冷凍設(shè)備體外冷凍C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液，方法簡單、經(jīng)濟(jì)。可通過控制氬氦冷凍設(shè)備的參數(shù)，獲取大量理想的全細(xì)胞凍融抗原，既能在直觀下觀察冷凍的過程，又為下一步研究DC疫苗準(zhǔn)備了足夠的冷凍抗原。
　　 第二部分:膠質(zhì)瘤氬氦凍融產(chǎn)物致敏Wistar大鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞治療顱內(nèi)膠質(zhì)瘤大鼠的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:建立Wistar大鼠骨髓源性樹突狀細(xì)

13、胞(DC)的分離和培養(yǎng)方法，觀察經(jīng)氬氦冷凍后C6膠質(zhì)痛細(xì)胞凍融產(chǎn)物對wistar大鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞(BM-DC)成熟的影響，了解致敏樹突狀細(xì)胞(DC)對荷C6腦膠質(zhì)瘤Wistar大鼠的治療作用。
　　 方法:設(shè)計(jì)雙循環(huán)氬氦冷凍法凍融體外C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液為實(shí)驗(yàn)組，只插入探針不作冷凍為陰性對照組，雙循環(huán)氬氦冷凍法凍融等量PBS為空白對照組;取wistar大鼠骨髓單核細(xì)胞，加入含40ng/mL重組大鼠白細(xì)胞介素-4(rmIL-4

14、)、40ng/mL重組大鼠粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用貼壁法純化。培養(yǎng)6天時(shí)加入100ngTNF-α，第7天時(shí)分別加入各組冷凍產(chǎn)物（按制備凍融抗原前腫瘤細(xì)胞數(shù)量與DC數(shù)量3:1的比例），48小時(shí)后光鏡下觀察DC細(xì)胞形態(tài);收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測各組DC細(xì)胞表面共刺激分子CD80和CD86指數(shù)，ELISA法檢測各組上清液中IL-12含量;立體定向下建立荷腦C6膠質(zhì)瘤Wi

15、star大鼠模型，分別于第3、10天于大鼠皮下注射各組致敏的DC，采用Kaplan-Meier和Log-rank分析比較各組大鼠中位生存期。
　　 結(jié)果:培養(yǎng)第9天的DC（加入凍融產(chǎn)物48小時(shí)），實(shí)驗(yàn)組具有成熟DC形態(tài)學(xué)特征，表面分子CD80、CD86陽性表達(dá)率、培養(yǎng)細(xì)胞上清中IL-12的分泌量高于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組DC疫苗治療的荷腦膠質(zhì)瘤大鼠中位生存期高于陰性對照組和空白對照組，差