豚鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立及機(jī)理探討.pdf

1、背景
　　 動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是多種因素長(zhǎng)期共同作用的結(jié)果。探明動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)理、篩選研究有效治療藥物是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，而建立一種與人類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)相一致或接近的整體動(dòng)物模型則是進(jìn)行上述研究的關(guān)鍵。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者使用鳥(niǎo)類(lèi)、鼠類(lèi)、兔、豬、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等用于實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化的研究，在取得諸多進(jìn)展的同時(shí)，也逐步發(fā)現(xiàn)模型的缺陷和不足，限制

2、了其應(yīng)用。研究資料提示，豚鼠是極少數(shù)通過(guò)LDL攜帶和轉(zhuǎn)運(yùn)大部分膽固醇的動(dòng)物之一，這點(diǎn)與人類(lèi)極為相似。其次，豚鼠血漿脂質(zhì)構(gòu)成、膽固醇和脂蛋白代謝方式上也與人類(lèi)存在諸多相似之處，對(duì)藥物治療的反應(yīng)性與臨床研究結(jié)果一致。提示將豚鼠作為由脂代謝紊亂造成的動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型，可能具有一定的優(yōu)勢(shì)。
　　 目的
　　 探索建立豚鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的方法，使模型具有典型的動(dòng)脈粥樣硬化病變特征。從整體、細(xì)胞和分子水平探討豚鼠動(dòng)脈粥樣硬化

3、的發(fā)病機(jī)制，并與另一種嚙齒類(lèi)動(dòng)物大鼠模型進(jìn)行平行比較，闡明豚鼠作為一種新型動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)所在。
　　 方法：
　　 將豚鼠和大鼠分別隨機(jī)分為正常、模型組1組和模型2組。正常對(duì)照組飼常規(guī)飼料，模型1組飼含0.5％膽固醇、10％豬油的高脂飼料，模型2組飼含1％膽固醇、10％豬油的高脂例料，連續(xù)10周的方法建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。觀測(cè)動(dòng)物體重、攝食量和狀態(tài)變化。誘導(dǎo)結(jié)束后首先檢測(cè)血清脂質(zhì)和肝臟脂質(zhì)的變化；酶聯(lián)免

4、疫吸附法測(cè)定血清CETP、LCAT、hs-CRP和Ox-LDL濃度；取主動(dòng)脈弓至胸主動(dòng)脈下端進(jìn)行蘇IV染色，觀察主動(dòng)脈壁內(nèi)脂質(zhì)沉積、動(dòng)脈粥樣硬化病灶而積百分比；取主動(dòng)脈根部至主動(dòng)脈弓部的動(dòng)脈進(jìn)行石蠟切片，Masson染色法觀察動(dòng)脈內(nèi)膜膠原纖維的變化，HE染色法分析內(nèi)膜面積/中膜面積、內(nèi)膜炎性細(xì)胞浸澗和內(nèi)膜表層斑塊的形成情況；免疫組化檢測(cè)皿管內(nèi)膜ABCA1、CD36、ICAM-1蛋白表達(dá)的變化；實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)肝臟PPARα、LCAT、

5、LDL-R、SR-BI mRNA相對(duì)表達(dá)的變化，對(duì)豚鼠SR-BI基因進(jìn)行克隆測(cè)序。
　　 結(jié)果：
　　 1.血脂和肝脂的變化
　　 高脂飼料誘導(dǎo)10周后，與正常組相比，豚鼠兩個(gè)模型組血漿TC、TG、LDL-C水平均顯著升高，形成了典型的高脂血癥。而大鼠只有模型1組LDL-C和模型2組TC、LDL-C出現(xiàn)顯著升高，且升高幅度明顯低于相同條件誘導(dǎo)的豚鼠。豚鼠和大鼠各模型紐肝臟TC和TG均顯著性升高，且升高幅度近似。<

6、br>　　 豚鼠模型1組和模型2組的血清HDL-C水平顯著升高了9.9和10.8倍，HDL的兩個(gè)主要亞型HDL3/HDL2比值也都顯著升高，HDL組成和分布發(fā)生變化，小顆粒的HDL3堆積。大鼠兩個(gè)模型組的血清HDL-C水平和HDL3/HDL2比值與正常組相比都末發(fā)生變化。
　　 2.動(dòng)脈粥樣硬化病變
　　 正常豚鼠和大鼠主動(dòng)脈壁光滑、平坦，內(nèi)皮細(xì)胞完整、連接緊密、緊貼于平直的內(nèi)彈力板上，平滑肌細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、排列整齊，無(wú)

7、炎癥細(xì)胞聚集，無(wú)斑塊形成。豚鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)10周后，主動(dòng)脈壁大體染色出現(xiàn)斑塊（脂質(zhì)斑塊）；高倍鏡下觀察（×400），內(nèi)膜明顯增厚（表現(xiàn)為大量單核/巨噬細(xì)胞來(lái)源的泡沫細(xì)胞堆積于內(nèi)膜表層）；內(nèi)膜單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與聚集增加，大量的泡沫細(xì)胞聚集形成斑塊；泡沫細(xì)胞內(nèi)富含脂質(zhì)，細(xì)胞外形成脂滴，破壞內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞之間的正常連接，使平滑肌細(xì)胞被這些脂質(zhì)包繞分割。少數(shù)病變嚴(yán)重的豚鼠主動(dòng)脈出現(xiàn)細(xì)胞外脂質(zhì)融合和纖維帽，形成纖維斑塊。但病灶內(nèi)

8、未發(fā)現(xiàn)明顯組織壞死、鈣化、斑塊破裂出血和血栓形成。按AHA的動(dòng)脈粥樣硬化分期標(biāo)準(zhǔn)，豚鼠模型組形成了Ⅱ-Va型動(dòng)脈粥樣硬化病變，介于動(dòng)脈粥樣硬化的早期和晚期之間。對(duì)豚鼠動(dòng)脈粥樣硬化病理變化進(jìn)行半定量分析，模型1和模型2組斑塊的發(fā)生率分別為70％（7/10）和75％（6/8），主動(dòng)脈斑塊面積％、纖維面積％、內(nèi)膜面積％，內(nèi)膜面積/中膜面積比值較正常對(duì)照紐都明顯升高。而相同條件誘導(dǎo)下大鼠動(dòng)脈管壁未形成明顯的動(dòng)脈粥樣硬化病變，半定量分析也無(wú)顯著變

9、化。
　　 3.分子機(jī)制研究
　　 與正常組相比，豚鼠模型組肝臟LDL-R mRNA表達(dá)下調(diào)，血漿Ox-LDL水平顯著升高，說(shuō)明豚鼠正常的LDL-C受體代謝途徑受阻，大量LDL被氧化修飾成Ox-LDL。同時(shí)豚鼠模型組主動(dòng)脈CD36蛋白表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明大量的Ox-LDL經(jīng)巨噬細(xì)胞膜CD36受體攝入細(xì)胞內(nèi)，形成泡沫細(xì)胞。豚鼠模型組血漿CETP水平顯著升高，一方面促進(jìn)小而斂密的LDL形成并沉積于動(dòng)脈，另一方面促進(jìn)小顆粒HDL3水

10、平相對(duì)升高。此外，豚鼠模型組血漿LCAT水平和肝臟LCATmRNA表達(dá)都顯著下降，表明LCAT催化HDL3向HDL2的酯化轉(zhuǎn)變減少，HDL成熟過(guò)程受阻，也是HDL3/HDL2比值升高的原因之一。豚鼠攝入高脂飲食后，主動(dòng)脈粘附分子ICAM-1蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)了炎性細(xì)胞的粘附與聚集：血漿hs-CRP1水平升高，提示豚鼠出現(xiàn)血管炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。而相同高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠只有模型2組血漿Ox-LDL、hs-CRP水平和主動(dòng)脈

11、CD36蛋白表達(dá)升高，且變化幅度不如豚鼠明顯。
　　 此外，高脂飲食的攝入導(dǎo)致豚鼠兩個(gè)模型組肝臟SR-BI mRNA和主動(dòng)脈ABCA1蛋白表達(dá)代償性升高，而大鼠未出現(xiàn)此變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用0.5％膽固醇和10％豬油的高脂膳食誘導(dǎo)豚鼠10周可建立典型的動(dòng)脈粥樣硬化模型。
　　 2.與大鼠相比較，豚鼠對(duì)飲食性膽固醇更敏感，通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)更易于形成動(dòng)脈粥樣硬化病變。
　　 3.豚鼠容易