柔嫩艾美耳球蟲耐藥株與敏感株差異基因篩選及膜骨架蛋白1的初步研究.pdf

1、柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）是一種單細(xì)胞胞內(nèi)寄生蟲，也是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的重要病原之一。目前對(duì)于球蟲病的防治，仍主要依靠于藥物。球蟲病防治藥物主要分為兩大類:離子載體類抗生素和化學(xué)合成藥物，馬杜拉霉素(Maduramycin)和地克珠利(Diclazuril)是這兩類藥物中比較具有代表性的藥物。在長(zhǎng)期用藥物控制球蟲病的同時(shí)，球蟲極易對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，為球蟲病的防治帶來(lái)了困境。為了能揭開(kāi)球蟲耐藥性神秘的面紗，實(shí)驗(yàn)室前期通

2、過(guò)藥物誘導(dǎo)獲得了馬杜拉霉素耐藥株和地克珠利耐藥株。為了探索球蟲的耐藥機(jī)制，本文利用RNA-seq方法比較了柔嫩艾美耳球蟲馬杜拉霉素耐藥株和地克珠利耐藥株與敏感株的差異，篩選出差異基因，分析了差異基因的相關(guān)功能，對(duì)差異表達(dá)基因膜骨架蛋白1(IMC1)的特性進(jìn)行了初步研究，為深入研究球蟲的耐藥機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)。
　　1.柔嫩艾美耳球蟲2個(gè)耐藥株的耐藥性檢測(cè)
　　為確定實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存的柔嫩艾美耳球蟲馬杜拉霉素耐藥株和地克珠利耐藥

3、株的遺傳穩(wěn)定性，采用雞體試驗(yàn)法，以抗球蟲指數(shù)(ACI)、最適抗球蟲活性百分率(POAA)、病變記分減少率(RLS)和相對(duì)卵囊產(chǎn)量(ROP)4項(xiàng)指標(biāo)，評(píng)價(jià)2個(gè)耐藥株對(duì)地克珠利、癸氧喹酯(Decoquinate)、馬杜拉霉素等3種抗球蟲藥物的耐藥性，并以柔嫩艾美耳球蟲敏感株為對(duì)照。結(jié)果顯示，敏感株對(duì)3種抗球蟲藥物均無(wú)耐藥性，4項(xiàng)指標(biāo)全部陰性。馬杜拉霉素耐藥株對(duì)馬杜拉霉素為完全耐藥，4項(xiàng)指標(biāo)全部陽(yáng)性。地克珠利耐藥株對(duì)地克珠利為完全耐藥，4項(xiàng)指

4、標(biāo)全部陽(yáng)性。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)室已繁殖保存10余年的柔嫩艾美耳球蟲2個(gè)耐藥蟲株對(duì)其誘導(dǎo)藥物具有完全耐藥性，實(shí)驗(yàn)室保種繁殖方法可行，蟲株遺傳穩(wěn)定性良好，為利用該蟲株進(jìn)行球蟲耐藥性相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2.基于RNA-seq方法進(jìn)行柔嫩艾美耳球蟲耐藥株與敏感株差異基因的篩選
　　利用RNA-seq方法篩選柔嫩艾美耳球蟲2個(gè)耐藥株與敏感株之間的差異基因，對(duì)耐藥株與敏感株孢子化卵囊進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析，篩選差異基因，與柔嫩艾美耳球

5、蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行差異基因的功能分類。結(jié)果顯示，地克珠利耐藥株與敏感株相比，上調(diào)基因330個(gè)，下調(diào)基因49個(gè)。馬杜拉霉素耐藥株與敏感株相比，上調(diào)基因672，下調(diào)基因398個(gè)。馬杜拉霉素耐藥株與地克珠利耐藥株相比，上調(diào)基因8個(gè)，下調(diào)基因20個(gè)。這些差異基因的生物學(xué)功能主要集中為參與代謝過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞形成、運(yùn)輸過(guò)程、生物合成、基因表達(dá)等，研究結(jié)果為探討球蟲耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　3.柔嫩艾美耳球蟲膜

6、骨架蛋白1基因功能特性的初步研究
　　根據(jù)柔嫩艾美耳球蟲耐藥株與敏感株轉(zhuǎn)錄組分析比較結(jié)果，選取耐藥株與敏感株的差異表達(dá)下調(diào)基因膜骨架蛋白1(IMC1)，利用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)，以柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊cDNA為模板克隆IMC1，經(jīng)過(guò)PCR和酶切鑒定正確后測(cè)序，將測(cè)序正確的序列連接到原核表達(dá)載體pGEX-4T-2中，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-EtIMC1，并在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組蛋白rEtIMC1，純化

7、蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，用RT-qPCR和Western-blot檢測(cè)EtIMC1在耐藥株和敏感株中的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平。結(jié)果顯示，EtIMC1在地克珠利耐藥株和馬杜拉霉素耐藥株中的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于敏感株，蛋白在耐藥株中為低表達(dá)，轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平趨勢(shì)一致。間接免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白位于蟲體表面，體外抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示用抗rEtIMC1多克隆抗體孵育后的子孢子入侵DF-1細(xì)胞，其入侵率比對(duì)照組下降80％。研究結(jié)果提示，EtIMC1