TAT-LBD-Ngn2對腦缺血損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、中風(fēng)是世界第二位、我國第一位的致死性疾病,更是成年人致殘的首要病因。而中風(fēng)后神經(jīng)元壞死和凋亡導(dǎo)致的神經(jīng)元缺失(loss of neuron)以及突觸功能異常則為中風(fēng)后神經(jīng)功能障礙的最根本原因。目前除了再灌注治療(t-PA,血管再通術(shù))可臨床應(yīng)用、造?；颊?抗興奮性毒性、抗氧化、抗凋亡、抗炎等新治療措施均在臨床實驗中因為效果不佳或毒副作用而失敗。因此,尋找能夠有效減輕腦缺血后神經(jīng)元損傷、抑制神經(jīng)元凋亡,促進神經(jīng)發(fā)生并重建神經(jīng)環(huán)路的新治療靶

2、點或藥物,成為了中風(fēng)治療的重點和難點。
　　成年哺乳動物神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)的發(fā)現(xiàn),為中風(fēng)后神經(jīng)功能康復(fù)帶來了曙光。而神經(jīng)源素2(Ngn2)作為 bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,在成年哺乳動物神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著極為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),Ngn2不僅是啟動神經(jīng)發(fā)生的重要因子,還參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的終末分化,調(diào)控神經(jīng)前體細胞的遷移與成熟,影響軸突投射和樹突形成。不僅如此,單純應(yīng)用Ngn2就可誘導(dǎo)胚胎干細胞、星形膠
　

3、　質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞前體細胞分化為具有相應(yīng)結(jié)構(gòu)和功能的成熟谷氨酸能神經(jīng)元;而轉(zhuǎn)染Ngn2還可促進移植后神經(jīng)前體細胞的存活、分化、遷移與成熟,參與損傷神經(jīng)環(huán)路和網(wǎng)絡(luò)的修復(fù)與重建,提示Ngn2可能成為中風(fēng)治療尤其是康復(fù)治療的重要作用靶點。然而,Ngn2因分子量過大,難以通過血腦屏障,限制了其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。而我們前期合成的具有血腦屏障通透性和損傷區(qū)域靶向性的TAT-LBD-Ngn2融合蛋白,為進一步明確Ngn2對缺血性腦中風(fēng)的

4、治療作用及其機制提供了研究基礎(chǔ)。
　　因此,本課題以原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元氧糖剝奪(OGD)模型和小鼠全腦缺血(GCI)模型為對象,應(yīng)用神經(jīng)行為學(xué)、免疫組織化學(xué)和western blot等技術(shù),觀察 TAT-LBD-Ngn2對缺血性腦損傷的短期和長期神經(jīng)保護作用,明確其對神經(jīng)發(fā)生的促進作用,并初步闡明 TAT-LBD-Ngn2神經(jīng)保護作用的機制,旨在為缺血性腦中風(fēng)治療提供新的干預(yù)靶點和治療藥物,并為Ngn2神經(jīng)保護作用的機制研究提供

5、新的思路。
　　實驗一 TAT-LBD-Ngn2對氧糖剝奪原代神經(jīng)元的保護作用及其機制研究
　　目的:通過離體研究,明確TAT-LBD-Ngn2對氧糖剝奪的原代培養(yǎng)神經(jīng)元是否具有保護作用,并初步探討其機制。
　　方法:采用原代培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)元,以125μg/L濃度的Ngn2、TAT-LBD、TAT-LBD-Ngn2分別孵育神經(jīng)元6h,通過免疫細胞化學(xué)觀察各藥物對細胞膜的通透性,并進一步明確各藥物對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元

6、神經(jīng)突生長的影響。再分為5組:Control組、OGD組、OGD+TAT-LBD-Ngn2(62.5μg/L)組、OGD+TAT-LBD-Ngn2(125μg/L)組和OGD+TAT-LBD-Ngn2(250μg/L)組。OGD復(fù)氧后24h后,應(yīng)用MTT比色法檢測神經(jīng)元細胞活力,應(yīng)用LDH釋放試驗檢測神經(jīng)元損傷程度,應(yīng)用TUNEL染色觀察神經(jīng)元的凋亡情況,并進一步應(yīng)用Elisa和Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3

7、、Bcl-2和Bax的表達水平。
　　結(jié)果:125μg/L的TAT-Ngn2和TAT-LBD-Ngn2均可通過細胞膜,并促進原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的神經(jīng)突生長(P<0.05)。OGD模型24h后,TAT-LBD-Ngn2組的細胞活力顯著提高(P<0.01),LDH釋放減少(P<0.01),并且細胞活力的改善與TAT-LBD-Ngn2的藥物濃度呈劑量依賴關(guān)系,250μg/L的TAT-LBD-Ngn2具有最大的神經(jīng)保護作用。同時,TAT-

8、LBD-Ngn2組TUNEL陽性神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少(P<0.05);促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達明顯受到抑制(P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2水平顯著增高(P<0.01),TAT-LBD-Ngn2的抗凋亡作用同樣具有劑量依賴性,于250μg/L時達到最大保護效果。
　　結(jié)論:TAT-LBD-Ngn2可透過神經(jīng)元細胞膜,促進神經(jīng)突生長;還可通過抑制內(nèi)源性和外源性的凋亡通路,減少神經(jīng)元凋亡,減輕缺血再灌注損傷。<

9、br>　　實驗二TAT-LBD-Ngn2對腦缺血損傷短期保護作用及其機制的研究
　　目的:通過在體研究,明確TAT-LBD-Ngn2對小鼠全腦缺血損傷是否具有保護作用,并初步探討其神經(jīng)保護作用的機制。
　　方法:采用C57BL/6小鼠,行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(BCCAO)術(shù)建立GCI模型,隨機分為Control組(PBS200μL, qd ip, n=30)和TAT-LBD-Ngn2組(TAT-LBD-Ngn2250μg/kg,

10、 qd ip, n=30),再灌注即刻首次給藥,此后每天進行藥物腹腔注射。首次藥物注射24h后通過免疫組織化學(xué)和Western Blot觀察藥物通過血腦屏障和細胞膜的情況。通過1d、2d和3d的總體運動評分(TMS)觀察BCCAO小鼠術(shù)后的神經(jīng)行為能力。應(yīng)用TUNEL染色觀察并計數(shù)BCCAO后3d神經(jīng)元的凋亡情況;并應(yīng)用免疫組織化學(xué)觀察神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF,NGF)在海馬和皮層的表達情況。
　　結(jié)果:在成功建立的全腦缺血模型小鼠

11、中,TAT-LBD-Ngn2可通過血腦屏障進入腦組織,并表達于海馬和皮層的神經(jīng)元和其他神經(jīng)細胞。同時,TAT-LBD-Ngn2因?qū)诱尺B蛋白的親和力和靶向性,在腦內(nèi)尤其是海馬區(qū)域的表達顯著高于TAT-Ngn2(P<0.01);TAT-LBD-Ngn2治療可改善BCCAO術(shù)后1d、2d和3d小鼠的TMS評分(P<0.05)。TAT-LBD-Ngn2治療還可顯著減少BCCAO術(shù)后3d海馬CA1區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)目(P<0.05);誘導(dǎo)

12、皮層神經(jīng)元BDNF的表達,但對NGF的表達則無明顯影響。
　　結(jié)論:TAT-LBD-Ngn2可透過血腦屏障,聚集于損傷區(qū)域;還可通過促進BDNF表達,抑制神經(jīng)元凋亡,減輕腦缺血再灌注損傷,改善運動功能。
　　實驗三 TAT-LBD-Ngn2對腦缺血損傷長期保護作用及其機制研究
　　目的:觀察TAT-LBD-Ngn2對小鼠全腦缺血損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響,并初步探討神經(jīng)發(fā)生在其中發(fā)揮的作用。
　　方法:采用 C57

13、BL/6小鼠,行 BCCAO術(shù)建立 GCI模型,隨機分為 Control組(PBS200μL, qd ip, n=30)和TAT-LBD-Ngn2組(TAT-LBD-Ngn2250μg/kg, qd ip, n=30),于再灌注時開始給藥,持續(xù)14或28d。于BCCAO后14、28d通過曠場試驗觀察小鼠的運動功能,通過Morris水迷宮檢測TAT-LBD-Ngn2對小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能的影響。通過免疫組織化學(xué),觀察并計數(shù)BCCAO后1

14、4、28d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量;觀察海馬齒狀回雙皮質(zhì)素(DCX)和溴脫氧尿苷(BrdU)陽性的新生神經(jīng)元數(shù)目;檢測突觸素(SYN)在腦內(nèi)的表達情況以明確新生神經(jīng)元是否建立了功能性突觸。
　　結(jié)果:兩組間小鼠的運動功能無統(tǒng)計學(xué)差異。但 Morris水迷宮結(jié)果顯示, TAT-LBD-Ngn2組小鼠在14d和28d的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05),空間探索試驗中的穿臺次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間也明顯優(yōu)于 Control組(P<0.05

15、),具有較好的空間學(xué)習(xí)和記憶功能。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示250μg/kg TAT-LBD-Ngn2可顯著提高海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量(P<0.05);并增加海馬齒狀回BrdU和DCX陽性神經(jīng)元的數(shù)目(P<0.05),這些新生神經(jīng)元主要位于海馬齒狀回的顆粒下層;此外,TAT-LBD-Ngn2還增加了皮層和海馬SYN的表達。
　　結(jié)論:TAT-LBD-Ngn2治療可促進缺血易損區(qū)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的存活,顯著改善 BCCAO小鼠的空間學(xué)

16、習(xí)和記憶功能,其作用可能是通過促進神經(jīng)發(fā)生,促進突觸結(jié)構(gòu)和功能的重建實現(xiàn)的。
　　小結(jié):通過上述研究證實,TAT-LBD-Ngn2可透過血腦屏障和細胞膜,富集于損傷區(qū)神經(jīng)元內(nèi);TAT-LBD-Ngn2可通過誘導(dǎo) BDNF的表達,抑制神經(jīng)元凋亡,減輕腦缺血早期損傷;TAT-LBD-Ngn2還可通過促進神經(jīng)發(fā)生、重建突觸結(jié)構(gòu)和功能,促進腦缺血性損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù),提示 TAT-LBD-Ngn2可能開發(fā)為臨床治療腦中風(fēng)的候選藥物。本研