芝麻酚對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、腦卒中是與腦組織損傷有關(guān)的一種急性腦血管事件，是目前威脅人類健康的重要疾病之一，也是致殘的主要原因之一。美國(guó)每年有79.5萬人罹患中風(fēng)。其中大約61萬是為新發(fā)病例，18.5萬為復(fù)發(fā)病例，平均每40秒美國(guó)有1人發(fā)生中風(fēng)。其中缺血性腦卒中占大約85％左右，其余為出血性腦卒中。而且隨著人口老齡化，缺血性腦卒中的發(fā)生率成逐年上升趨勢(shì)。溶栓和血管再通是缺血性腦卒中的主要治療手段。目前靜脈應(yīng)用重組纖溶酶原激活物(recombinant plasmi

2、nogen activator，rtPA)溶栓的治療時(shí)間窗狹窄，而且在卒中的治療指南中，rtPA的應(yīng)用有嚴(yán)格的適應(yīng)證和禁忌證，僅僅2％～5％的中風(fēng)患者有機(jī)會(huì)得到這種治療，而且接受治療的患者中大約有50％的患者會(huì)出現(xiàn)腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)。CIRI的病理生理機(jī)制極其復(fù)雜，有多個(gè)損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與，例如體內(nèi)離子失衡，ATP損耗，大量釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，氧自由基過度

3、產(chǎn)生、炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等。因此尋求多靶點(diǎn)的神經(jīng)保護(hù)藥物，試圖減輕CIRI成為醫(yī)學(xué)界研究的重要課題。盡管針對(duì)這些機(jī)制，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中一些抗炎劑、抗氧化劑等顯示了一定的治療效果，但是眾多臨床實(shí)驗(yàn)未達(dá)到預(yù)期效果。所以近年來人們愈發(fā)強(qiáng)烈地意識(shí)到尋找具有多種生物學(xué)活性，能多靶點(diǎn)、多個(gè)途徑治療卒中，而且毒副作用小的天然植物有效成分已為研究的熱點(diǎn)，以便為新型神經(jīng)保護(hù)劑的開發(fā)和研制提供更加廣闊的思路。
　　芝麻酚(sesamol)又稱5-羥基-

4、1，3-苯并二氧雜環(huán)戊烯，胡麻屬植物的天然提取物，是芝麻油的主要香氣成分，芝麻油的脫脂抗氧化劑之一，呈水溶性，能通過血腦屏障，具有多種生物學(xué)活性。芝麻油為中國(guó)和印度等東南亞國(guó)家的傳統(tǒng)健康補(bǔ)充劑，同其他的膳食油（如花生油、玉米油、葵花籽油）相比，芝麻油具有更好的抗高血壓、調(diào)解血脂、抗疲勞和抗衰老的效果。目前芝麻已經(jīng)被西方中藥師所接受，并用于各種治療目的。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明芝麻酚具有很強(qiáng)的抗炎、抗氧化、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)等特點(diǎn)，其比白藜

5、蘆醇和葵花籽油衍生物具有更強(qiáng)的抗氧化性能和抗腫瘤特性。它對(duì)藥物和理化因素導(dǎo)致的重要臟器損傷有效。目前一些臨床研究也發(fā)現(xiàn)芝麻衍生物的抗疲勞、抗衰老、抗癌、調(diào)脂、降壓、減輕糖尿病并發(fā)癥等功效。而且近年來人們又發(fā)現(xiàn)芝麻酚有神經(jīng)保護(hù)功能，其在3-硝基丙酸、鏈脲霉素等誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙、糖尿病相關(guān)性認(rèn)知功能障礙，魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森大鼠模型中均顯示顯著的治療療效;研究還發(fā)現(xiàn)芝麻酚有助于維護(hù)神經(jīng)血管單元細(xì)胞的完整性，改善糖尿病患者血腦屏障(blood

6、 brain barrier,BBB)的通透性;給大鼠長(zhǎng)期喂食芝麻酚可以影響其大腦組織中神經(jīng)生長(zhǎng)因子的水平和大麻素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)而發(fā)揮抗抑郁性能，而且其功效與經(jīng)典抗抑郁藥阿米替林相似，但副作用更小。體外研究也發(fā)現(xiàn)，芝麻酚在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可以減少NO、H202的生成，減弱單胺氧化酶活性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。芝麻酚對(duì)參與中風(fēng)的病理機(jī)制中的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)都有抑制作用，而且對(duì)中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)因素如高血壓、糖尿病、高脂血癥等都顯示

7、出治療作用，如果證實(shí)芝麻酚是治療中風(fēng)的多靶點(diǎn)、多維度起作用的理想神經(jīng)保護(hù)劑，將會(huì)有很重要的意義。
　　本研究第一部分采用大鼠的腦缺血再灌注模型，探討芝麻酚對(duì)神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗塞體積、腦水腫以圾腦組織病理學(xué)改變以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響;第二部分評(píng)估芝麻酚對(duì)腦缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激，凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)和炎性反應(yīng)的影響，以了解芝麻酚發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。
　　第一部分 芝麻酚對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)效果的研究
　

8、　目的:探討芝麻酚對(duì)腦缺血再灌注損傷大腦中動(dòng)脈閉塞模型的腦保護(hù)效果。
　　方法:成年SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組，腦缺血再灌注(MCAO)組、腦缺血再灌注+芝麻酚小劑量(MCAO+sesamol A)組和腦缺血再灌注+芝麻酚大劑量(MCAO+sesamol B)組，sham組只暴露和游離大腦中動(dòng)脈，不經(jīng)歷缺血再灌注的過程。其余三組大腦中動(dòng)脈阻塞2h，再灌注24h。在MCAO+sesamol A組和MCAO+sesamol

9、B組誘導(dǎo)MCAO前，分別連續(xù)7d腹膜注射15mg·kg-1·d-1和25mg·kg-1·d-1的芝麻酚。Sham組和MCAO組連續(xù)7d注射相同劑量的溶劑作為對(duì)照。腦缺血再灌注前后觀察各組大鼠的生命體征（心率、呼吸、血氧飽和度和體溫）。在腦缺血2h再灌注24h后，采用盲法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分;TTC法對(duì)腦組織切片進(jìn)行染色，并計(jì)算腦梗死體積，干濕重法測(cè)量腦水腫程度;并通過HE染色觀察神經(jīng)細(xì)胞的病理組織學(xué)改變、TUNEL法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋

10、亡的表達(dá)，SABC免疫組化染色法檢測(cè)腦組織caspase-3的表達(dá)。
　　結(jié)果:與sham組相比，MCAO組的大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低(P＜0.05)。而MCAO+sesamol A組和MCAO+sesamol B組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分與MCAO組相比顯著得到改善(P＜0.05)而且呈現(xiàn)劑量依賴性;而且MCAO+sesamol A組和MCAO+sesamol B組與MCAO組比較腦梗死體積、腦水腫的程度均顯著減輕（P＜0.05）;

11、sham組神經(jīng)元和組織毛細(xì)血管的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，MCAO組的神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生皺縮，細(xì)胞核染色深，有些呈現(xiàn)出三角形，核仁消失，伴有空泡形成，細(xì)小血管網(wǎng)中斷。MCAO+sesamol A組和MCAO+sesamol B組的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變明顯減輕，而且MCAO+sesamol B組改善更明顯;Tunel染色結(jié)果顯示sham組僅有少量的凋亡陽性細(xì)胞，與sham組相比較MCAO組在光鏡下可見大量的凋亡細(xì)胞。與MCAO組相比，MCAO+sesamo

12、l A組和MCAO+sesamol B有較低的細(xì)胞凋亡指數(shù)，大劑量組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目減少更加明顯;免疫組化染色結(jié)果顯示，腦缺血2h再灌注24h sham組僅見少量的caspase-3陽性細(xì)胞，與sham組比較，MCAO組caspase-3陽性細(xì)胞大量增加（P＜0.01）。與MACO組比較MCAO+sesamol A組和MCAO+sesamol B組caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，MCAO+sesamol B組減少更顯著(P＜0.0

13、1)。
　　結(jié)論:在腦缺血再灌注損傷大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠模型中預(yù)防性腹腔內(nèi)注射芝麻酚可以改善大鼠腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺陷，減小腦梗塞體積，減輕腦水腫，改善神經(jīng)細(xì)胞的病理學(xué)改變，減輕細(xì)胞凋亡。
　　第二部分 芝麻酚對(duì)腦缺血再灌注損傷氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)的影響
　　目的：探討芝麻酚對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷急性期保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法：SD大鼠被隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(sham)；大腦中動(dòng)脈

14、閉塞組(middle cerebralartery occlusion，MCAO)；大腦中動(dòng)脈閉塞+芝麻酚組(MCAO+Sesamol)。線栓法制作大腦中動(dòng)脈閉塞模型，腦缺血2h，再灌注24h。MCAO+Sesamol組在腦缺血再灌注模型制作前，連續(xù)7d腹腔注射25mg·k-1·d-1的芝麻酚進(jìn)行預(yù)處理。Sham組只分離暴露大腦中動(dòng)脈，不做缺血再灌注手術(shù)。Sham組和MCAO組在相同條件下，連續(xù)腹腔注射生理鹽水作為對(duì)照。再灌注后24 h

15、后，評(píng)估缺血腦組織丙二醛(MDA)含量和抗氧化應(yīng)激物質(zhì)：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的水平。此外，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng) RToqPCR)方法檢測(cè)大腦組織中炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IL-8的水平。最后， 應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western Blot)法測(cè)定Bcl-2、Bax和caspase-3的表達(dá)。
　　結(jié)果：腦缺血2h，再灌注24h后，與sham組比較，MCAO組的

16、大鼠腦組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的水平顯著升高；而抗氧化物SOD、GSH和GPx的水平顯著降低；促炎性介質(zhì)IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)增高；凋亡相關(guān)蛋白Bax和caspase-3(1.13+0.26 VS.0.36+0.05，P<0.05)的水平升高，而Bcl-2水平降低(0.50±0.03 VS.1.60±0.09，P<0.05)。與MCAO組相比，在腦缺血再灌注前7d連續(xù)使用芝麻酚25mg·kg-l·d-1進(jìn)行預(yù)處理，可以降低M

17、DA的含量(2.45±0.44 VS.4.15±0.36，P<0.05)、提高腦組織的抗氧化SOD(92.15+8.82 VS.65.1 5±7.57，P<0.05)、GSH(4.45+0.55 VS.3.55±0.52，P<0.05)和GPx(5.25±1.07 VS.3.21±0.96，P<0.05)的水平。此外，在芝麻酚干預(yù)下，促炎癥細(xì)胞因子IL-6(0.38±0.04 VS.1.40±0.11，P<0.05)和TNF-a mRN

18、A表達(dá)明顯降低(0.33±0.08 VS.1.17±0.35，P<0.05)，凋亡相關(guān)蛋白Bax(1.10±0.08 VS.1.80±0.25，P<0.05)和caspase-3(O.70±0.06 VS.1.13±0.26，P<0.05)的水平較MCAO組顯著下調(diào)，而Bcl-2的水平得到提高(1.20±0.09 VS.0.50±0.03，P<0.05)。
　　結(jié)論：芝麻酚可通過減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)減輕腦缺