AD細(xì)胞模型對VEGF和FoxO3a-p-FoxO3a蛋白表達(dá)的影響及六味地黃丸干預(yù)作用機(jī)制研究.pdf

1、　　目的：
　　1 觀察不同濃度 Aβ25-35 對 PC12 細(xì)胞活力和細(xì)胞形態(tài)及血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子3a (Forkhead-like protein 3, FoxO3a)、磷酸化叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子p-FoxO3a蛋白表達(dá)的影響,選擇適合血清藥理實驗的AD細(xì)胞模型條件。
　　2觀察不同濃度六味地黃丸含藥血清(Liuweidi

2、huang serum, LWDHS)對PC12細(xì)胞活力和細(xì)胞形態(tài)及VEGF、FoxO3a、P-FoxO3a蛋白表達(dá)的影響,選擇對PC12細(xì)胞功能影響明顯的 LWDHS 含藥血清濃度,并初步探討 LWDHS 作用于 PC12細(xì)胞的分子機(jī)制。
　　3 用合適濃度的 LWDHS 含藥血清干預(yù) AD 細(xì)胞模型,觀察六味地黃丸含藥血清(LWDHS)對AD細(xì)胞模型細(xì)胞活力和細(xì)胞形態(tài)及VEGF、FoxO3a、p-FoxO3a蛋白表達(dá)的影響,

3、并分析其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1 MTT法檢測10μmol/L、20μmol/L、40μmol/LAβ25-35對PC12細(xì)胞活力的影響并觀察細(xì)胞形態(tài)的變化,用Western Blot方法檢測Aβ25-35對PC12細(xì)胞中VEGF、FoxO3a及p-FoxO3a蛋白表達(dá)的變化。
　　2 制含藥血清：SD雄性大鼠(250±20g),六味地黃丸濃縮丸(宛西制藥), 1.08g/kg灌胃,每天2次,第4天早上灌胃

4、后2小時腹主動脈取血制備 LWDHS。
　　3將LWDHS分為2.5%、5%、10%、20%、30%五個濃度組,篩選促使PC12細(xì)胞活力增強(qiáng)的最佳濃度,并觀察細(xì)胞形態(tài)變化及 Western Blot方法檢測相關(guān)蛋白(VEGF,FoxO3a,p-FoxO3a)蛋白表達(dá)變化。
　　4取最佳濃度 LWDHS干預(yù) Aβ25-35誘導(dǎo)的 AD細(xì)胞模型,顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、活力及Western Blot方法檢測VEGF,FoxO3a

5、,p-FoxO3a蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1 10、20、40 μmol/L Aβ25-35干預(yù)PC12細(xì)胞后,細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),隨著 Aβ25-35劑量增高,PC12 細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞形狀變得不規(guī)則,有細(xì)胞碎片出現(xiàn)和凋亡/死亡細(xì)胞逐漸增多。同時檢測PC12細(xì)胞中VEGF 和FoxO3a/p-FoxO3的表達(dá),結(jié)果表明VEGF 和p-FoxO3蛋白表達(dá)降低,而FoxO

6、3a的表達(dá)升高。
　　2 2.5%、5%、10%、20%、30%5個濃度的LWDHS干預(yù)的PC12細(xì)胞細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.01)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),隨著LWDHS濃度增高, PC12細(xì)胞數(shù)目增多,細(xì)胞聚集成片狀生長,形態(tài)拉伸。同時觀察到20%、30%濃 度組PC12細(xì)胞長出小的棘突,具有分化趨勢。同時用Western Blot方法VEGF 和FoxO3a/p-FoxO3的表達(dá),結(jié)果顯示 VEGF蛋白表達(dá)明顯增高,

7、FoxO3a蛋白表達(dá)降低,而p-FoxO3的表達(dá)也隨著濃度的增加而增加。
　　3 LWDHS 干預(yù)組與正常對照組 PC12 細(xì)胞存活率比較無顯著差異,LWDHS干預(yù)組與模型對照組 PC12細(xì)胞存活率明顯增高(P<0.01)。模型對照組與正常對照組 PC12 細(xì)胞存活率比較明顯降低( P<0.01)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài), LWDHS干預(yù)組、模型對照組與正常對照組相比,PC12細(xì)胞細(xì)胞數(shù)減少,細(xì)胞變大,形態(tài)不規(guī)則,有細(xì)胞碎片出

8、現(xiàn)。LWDHS 干預(yù)組與模型對照組相比,凋亡細(xì)胞減少。Western Blot方法檢測結(jié)果：與正常對照組相比,VEGF的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),FoxO3a 的蛋白表達(dá)增高(P<0.01),p-FoxO3a 的蛋白表達(dá)顯著降低；與模型組相比,LWDHS 干預(yù)組 VEGF 的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01), FoxO3a的蛋白表達(dá)降低(P<0.01),p-FoxO3a的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。
　　結(jié)論： <

9、br>　　1 Aβ25-35 對 PC12 細(xì)胞毒性損傷與劑量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān), Aβ25-35 對VEGF,FoxO3a,p-FoxO3a 表達(dá)的影響,表明 Aβ 在導(dǎo)致阿爾茨海默病發(fā)生的神經(jīng)元凋亡和血管因素中起著重要作用。
　　2 LWDHS 對正常 PC12 細(xì)胞和 AD 模型細(xì)胞的增殖和對 VEGF,FoxO3a, p-FoxO3a具有很大影響,說明六味地黃丸能夠通過調(diào)節(jié)血管調(diào)節(jié)因子及凋亡相關(guān)因子表達(dá)對阿爾茨海默病起