雞傳染性支氣管炎重組雞痘疫苗免疫效力的研究.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(AvianInfectiousBronchitis)是由冠狀病毒屬的冠狀病毒引起的高度接觸性傳染病，是嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一。我國在防制雞傳染性支氣管炎過程中，目前通常采用馬薩諸塞(Massachusetts)血清型疫苗H120,H52，還有許多由地方分離株通過雞胚致弱制備的商品化活疫苗。但由于我國大量雞傳染性支氣管炎病毒不同血清型的出現(xiàn)，對感染異種IBV分離株而發(fā)病的免疫雞群不能提供完全的保護作用，造成了我國免

2、疫雞群中IB頻繁發(fā)生的原因之一。禽痘病毒載體疫苗在生產(chǎn)實踐中已被證實為一種安全有效的疫苗，部分產(chǎn)品已經(jīng)投入使用。本課題組已構(gòu)建rFPV-S1-IFNγ和rFPV-S1，前期試驗效果良好。本研究對其免疫效力進行了重組雞痘病毒疫苗同弱毒疫苗比較試驗、最小免疫劑量測定、安全性、遺傳穩(wěn)定性、不同條件保存對疫苗效價的影響等工作，為疫苗進一步的中試和推廣作鋪墊。 為了檢測重組病毒的遺傳穩(wěn)定性，rFPV-S1-IFNγ與rFPV-S1用雞胚成

3、纖維細胞接種傳代至30代，取第15、20、25、30代重組病毒作為受檢代次。病毒蝕斑檢測證明，重組病毒的效價在2×105上下波動，X-gal顯色后所有蝕斑均呈藍色；提取重組病毒基因組DNA，分別用S1和雞Ⅱ型干擾素基因基因特異性引物進行PCR擴增，4個代次的重組病毒rFPV-S1-IFNγ均檢測到了大小分別為660bp和500bp目的片段，在重組病毒rFPV-S1中也均檢測到了660bp的S1基因特異性片段，序列測定表明2個外源基因在細

4、胞傳代過程中沒有發(fā)生核苷酸和氨基酸的改變；間接免疫熒光檢測顯示各代次重組病毒中插入的外源基因均能表達，在熒光顯微鏡下觀察到了特異性熒光。結(jié)果表明，重組雞痘病毒具有較好的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)過30代的傳代后外源基因能夠穩(wěn)定表達。 將共表達傳染性支氣管炎病毒S1基因和雞Ⅱ型干擾素基因的重組雞痘病毒用生理鹽水恢復至原體積，取0.1ml翅膀內(nèi)側(cè)無血管處接種1周齡SPF雞(相當于1.0×105PFU/羽)。結(jié)果表明，即使采用原倍重組疫苗注射試驗

5、雞也不會引起試驗雞發(fā)病，重組疫苗對試驗雞是安全的。 將100只4周齡SPF雞分為4個組，分別免疫rFPV-S1-IFNγ、rFPV-S1、H120，并設(shè)PBS對照，免后4周用IBVLX4株攻擊。結(jié)果13/22的雞免疫rFPV-S1-IFNγ后能獲得保護，rFPV-S1免疫組和H120的保護率分別是18/24和17/22。rFPV-S1-IFNγ免疫后能縮短IBV呼吸道排毒時間及病毒抗原在腎臟組織中存在時間，僅在攻毒后的6-8d可

6、以在喉拭子和腎臟組織中檢測到病毒和病毒抗原，比rFPV-S1和H120弱毒疫苗免疫組分別縮短了2d。H120弱毒疫苗和重組雞痘病毒免疫組肝、脾、腎、肺和氣管的病理變化輕微，rFPV-S1-IFNγ免疫組在攻毒后的第16d觀察到病理變化，比rFPV-S1和H120弱毒疫苗免疫組攻毒后病變持續(xù)時間短了4d.試驗雞的血清學和外周血T淋巴細胞亞群的監(jiān)測表明，疫苗接種后3周全部實驗雞均為IBV抗體陽性，其中，H120弱毒疫苗免疫組抗體水平最高，其

7、次是rFPV-S1免疫組，rFPV-S1-IFNγ免疫組的抗IBV抗體水平最低。除了rFPV-S1-IFNγ免疫組CD4+T淋巴細胞攻毒前下降較為明顯，TCRγδ+和CD8+T淋巴細胞比例是最高的，其余各免疫組外周血CD4+T、CD8+T和TCRγδ+淋巴細胞變化水平比較平穩(wěn)。上述試驗結(jié)果說明rFPV-S1-IFNγ促進了CD8+T淋巴細胞的成熟，抑制外周血中CD4+T淋巴細胞數(shù)量。提高了機體的細胞免疫水平，限制了機體B淋巴細胞的活化以

8、及特異性抗體的產(chǎn)生；同時，rFPV-S1-IFNγ還能抑制活疫苗免疫接種引起的試驗雞增重降低作用，rFPV-S1-IFNγ的免疫試驗雞的增重沒有受到疫苗接種的影響，與rFPV-S1和H120弱毒疫苗免疫組有顯著差異。 Ⅰ將rFPV-S1-IFNγ和rFPV-S1分別10倍滴度稀釋后接種4周齡SPF雞(1.0×104PFU/羽、1.0×103PFU/羽、1.0×102PFU/羽、1.0×10PFU/羽)，免后4周用IBVLX4株攻

9、擊。結(jié)果表明，rFPV-S1-IFNγ免疫后，當免疫劑量大于100PFU時，rFPV-S1-IFNγ免疫組的保護率在72％以上。最高可以達到91.7％；rFPV-S1免疫后，不同劑量(10PFU、100PFU、1000PFU和10000PFU)免疫組對強毒攻擊的保護率在60％-70％之間。同時將重組雞痘疫苗分別放置于-20℃、4℃和常溫條件下保存，測定其疫苗效價是否變化。結(jié)果表明重組雞痘凍干疫苗在-20℃條件下保持1年效價變化甚微，在4