雞傳染性支氣管炎免疫膠體金診斷試紙研究.pdf

1、由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的雞傳染性支氣管炎(1B)(簡(jiǎn)稱雞傳支)由丁病毒具有多血清型和多組織嗜性，易丁發(fā)生變異而難以防制，成為養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的重大阻力。世界各國(guó)都非常重視，對(duì)其進(jìn)行了人量研究。目前雞傳支確切診斷依賴于病毒的分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)以及電鏡技術(shù)等。血清學(xué)診斷方法包括血凝及血凝抑制實(shí)驗(yàn)，神經(jīng)氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)，瓊脂糖擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，病毒中和實(shí)驗(yàn)，酶聯(lián)免疫吸

2、附實(shí)驗(yàn)，免疫熒光技術(shù)等。但這些檢測(cè)方法由于檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)及檢測(cè)所需儀器設(shè)備較昂貴，多數(shù)不適于臨床快速檢測(cè)。因此，新型快速檢測(cè)雞傳支的方法急需建立，本研究利用免疫膠體金層析技術(shù)初步實(shí)現(xiàn)了對(duì)雞傳支的快速檢測(cè)，對(duì)雞傳支的快速檢測(cè)具有重要意義。 本研究將雞傳染性支氣管炎病毒C型株尿囊液經(jīng)蔗糖梯度密度離心純化制取抗原，免疫BALB/C小鼠，將4次免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/O骨髓瘤細(xì)胞融合，融合率達(dá)68.3％。經(jīng)間接ELISA檢測(cè)、有限稀釋

3、法克隆，篩選出了2株能穩(wěn)定分泌特異性抗雞傳染性支氣管炎抗體的雜交瘤細(xì)胞株，依次命名為4D4、4D6，2株單抗的亞類都屬丁lgG1，k型。ElISA檢測(cè)時(shí)僅與IBV發(fā)生特異性反應(yīng)，而與其他常見(jiàn)禽類病毒抗原不出現(xiàn)交義反應(yīng)。獲得的單克隆抗體是制備雞傳染性支氣管炎免疫膠體金快速診斷試紙條的理想試劑。 用IBV C型雞傳支油乳劑疫苗對(duì)兔子進(jìn)行長(zhǎng)期免疫，用間接ELISA方法和瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(AGP)進(jìn)行檢測(cè)，得到了高效價(jià)的兔抗IBV多克隆抗體

4、。其效價(jià)分別為：ELISA法效價(jià)達(dá)1∶10萬(wàn)以上，AGF法效價(jià)在1∶16-1∶32之間。本實(shí)驗(yàn)用獲得的單克隆抗體和多克隆抗體建立了雞傳支病毒的膠體金免疫層析快速診斷方法。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求制備了30 nm的膠體金顆粒，對(duì)單克隆抗體(4D4株)最適穩(wěn)定標(biāo)記量進(jìn)行測(cè)定，選擇100 ml 0.01％金溶膠中的IBV單抗標(biāo)記量為12 ug/ml。通過(guò)最適穩(wěn)定標(biāo)記量對(duì)單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，成功制備了性能穩(wěn)定、免疫學(xué)活性好的金標(biāo)IBV單克隆抗體，該金標(biāo)抗體

5、在4℃保存半年有沉淀或分層現(xiàn)象。 將制備好的金標(biāo)抗體及經(jīng)辛酸一飽和硫酸銨法提純的兔抗IBV IgG用于免疫膠體金診斷試劑條的制備。反應(yīng)體系將金標(biāo)抗體固定于玻璃纖維膜上作為顯色源，將兔抗IBV IgG包被在硝酸纖維素膜上作為捕獲線，羊抗鼠IgG同定硝酸纖維素膜上作為質(zhì)檢線，通過(guò)確定各部分最佳噴涂量后制成免疫膠體金診斷試紙條。在檢測(cè)過(guò)程中若待檢樣晶中含有IBV抗原，則在有效的檢測(cè)試劑條上捕獲線和質(zhì)檢線處均出現(xiàn)一條紅線，若待檢樣品中不

6、含IBV抗原則只在質(zhì)檢線處出現(xiàn)一條紅線。通過(guò)結(jié)果的判定，該快速檢測(cè)測(cè)試條靈敏度可達(dá)5 ng/ml。同時(shí)本試驗(yàn)用單克隆抗體和多克隆抗體建立了雙抗體夾心ELISA法用丁檢測(cè)雞傳染性支氣管炎病毒，該方法靈敏度可達(dá)3.75 ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線在3.75ng/ml-500ng/ml范圍內(nèi)線性良好。通過(guò)與免疫膠體金診斷方法進(jìn)行比較，二者檢測(cè)符合率達(dá)90％以上。 本研究成功制備了抗IBV的多克隆抗體及抗IBV共同表何的單克隆抗體，并將其應(yīng)用