基于玉米醇溶蛋白的組織工程血管支架及三維細(xì)胞培養(yǎng)材料的制備研究.pdf

1、組織工程是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要發(fā)展方向，而血管組織工程和高密度三維細(xì)胞培養(yǎng)是其中的重要組成部分。在發(fā)達(dá)國(guó)家，心血管疾病是人類(lèi)的頭號(hào)殺手。近年來(lái)，隨著人民生活水平的提高，國(guó)內(nèi)的心血管疾病的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。研究者希望開(kāi)發(fā)出一種生物相容性好且可降解的人造血管，以解決目前臨床上面臨的問(wèn)題。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是一種介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間的技術(shù)，通過(guò)模擬體內(nèi)環(huán)境，展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢(shì)，用于進(jìn)行藥物毒性篩查試驗(yàn)。更為

2、重要的是，三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以直接為組織工程和器官再生提供足量的細(xì)胞和組織塊。
　　課題組前期的研究表明，玉米醇溶蛋白與NIH3T3細(xì)胞、HUVEC等有良好細(xì)胞相容性，并可以被用于骨缺損填充材料等領(lǐng)域。對(duì)于血管組織工程來(lái)說(shuō)，不僅要求細(xì)胞在生物材料上黏附、鋪展和增殖，還要求材料表面細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抗流體剪切力的能力，因?yàn)檩^高的細(xì)胞殘留率可以加快內(nèi)皮層的形成，有利于抵抗血栓和內(nèi)膜增生，提高手術(shù)的成功率。我們通過(guò)在基材表面制備不同粗糙度

3、的玉米醇溶蛋白微球涂層，以期提高細(xì)胞的抗流體剪切力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)浸泡在二次水中26小時(shí)并經(jīng)過(guò)6小時(shí)的流體剪切力沖擊后，最高粗糙度的玉米醇溶蛋白涂層3（表面由直徑大于500nm的微球構(gòu)成）上的微球結(jié)構(gòu)仍然清晰可見(jiàn)，和起始狀態(tài)沒(méi)有顯著差異；而粗糙度較低的玉米醇溶蛋白涂層2（表面由直徑小于500 nm的微球構(gòu)成）上的微球結(jié)構(gòu)消失。也就是說(shuō)，由高粗糙度和大尺寸玉米醇溶蛋白微球形成的二維涂層在外力作用下最能保持微觀形貌結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。在不同粗糙度的三種玉

4、米醇溶蛋白涂層表面的細(xì)胞也表現(xiàn)出不同的抗流體剪切力沖擊的能力：EA.hy926細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞在玉米醇溶蛋白涂層3上的細(xì)胞殘留率均高于其它兩種涂層；NIH3T3細(xì)胞在較低粗糙度的涂層2的抗流體沖擊能力也顯著高于最低粗糙度的涂層1，而EA.hy926細(xì)胞沒(méi)有顯著差異。以上結(jié)果說(shuō)明通過(guò)控制材料表面的微觀結(jié)構(gòu)，能夠在一定程度上改善細(xì)胞的抗流體剪切力沖擊的能力。
　　由于玉米醇溶蛋白的可降解性，還可以被應(yīng)用于血管組織工程。我們通過(guò)反

5、復(fù)涂布的方法制備了玉米醇溶蛋白管，并對(duì)其進(jìn)行了改性。經(jīng)過(guò)60、90和121℃濕熱處理的樣品，其體外胰酶降解速率從第3天開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異，并且是按照處理溫度的高低順序排列。為期6個(gè)月的動(dòng)物皮下植入試驗(yàn)也獲得同樣結(jié)果，即隨著處理溫度的增加，降解速率逐漸下降。另一方面，從力學(xué)強(qiáng)度上看，經(jīng)過(guò)濕熱處理的樣品其軸向拉伸強(qiáng)度、徑向拉伸強(qiáng)度和穿線牽拉強(qiáng)度均增加，并能夠隨溫度的增加而增加，但是處理溫度超過(guò)90℃之后，力學(xué)強(qiáng)度的增強(qiáng)不顯著。而且，所制備的玉

6、米醇溶蛋白管在體外進(jìn)行的長(zhǎng)期（28天）沖擊后仍能保持完整的管型結(jié)構(gòu)不漏液。通過(guò)控制玉米醇溶蛋白的處理?xiàng)l件，可以達(dá)到控制其降解速率和改善力學(xué)性能的目的，獲得符合要求的玉米醇溶蛋白人造血管。
　　現(xiàn)有的三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)包括薄膜堆砌、微球堆砌和多孔支架等方法。用于微流控系統(tǒng)和細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)都是重要的細(xì)胞培養(yǎng)材料。我們實(shí)驗(yàn)證明玉米醇溶蛋白薄膜在干燥狀態(tài)下具有較好透明性，考慮將其用于細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)材料，取代石油工業(yè)產(chǎn)品的聚苯乙烯等不可降解高分

7、子。為了解決溶脹引起的玉米醇溶蛋白薄膜不透明，影響細(xì)胞觀察的缺點(diǎn)，使用了濕熱處理（121℃，100％濕度和103.4 KPa，處理20分鐘）提高光透過(guò)率的方法。該方法不僅能夠降低溶脹率，在溶脹后仍維持較高的透明度，而且降低了薄膜基質(zhì)的降解速率。FT-IR和XRD分析表明，該處理?xiàng)l件降低了蛋白三維結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)比例，同時(shí)β-折疊結(jié)構(gòu)比例上升。而且處理和未處理的薄膜對(duì) NIH3T3的增殖沒(méi)有明顯影響。由此獲得的性能改進(jìn)拓寬了玉米醇溶蛋白

8、的應(yīng)用范圍，可用于細(xì)胞培養(yǎng)基材和微流控裝置材料。
　　玉米醇溶蛋白作為一種天然可降解生物材料，還可能用于細(xì)胞高密度培養(yǎng)的微載體領(lǐng)域，與組織工程有機(jī)結(jié)合起來(lái)。我們發(fā)明了三種制備微載體的方法，第一種方法是直接將其切割成長(zhǎng)方形顆粒，并經(jīng)過(guò)濕熱處理使其直角部分變彎曲；第二種方法首次使用了甘油加熱成球的方法成功制備了直徑在50-500μm的球形微載體；第三種方法首次使用酸堿中和滴加成球法制備了直徑在500-3000μm的球形微載體。我們?cè)谶@